一、研究背景膀胱移行细胞癌(Bladder transitional cell carcinoma，BTCC)是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，虽约70％以上为浅表性肿瘤，但术后易复发、易进展。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)定期膀胱灌注是目前预防浅表性BTCC术后复发最有效的方法，在减少BTCC术后肿瘤复发数目、降低复发频率等方面，BCG均明显优于传统化疗药物，也是目前认为唯一可预防肿瘤进展的免疫制剂。虽如此，仍有约30％左右的患者BCG治疗和预防效果不理想，同时，BCG膀胱灌注具有较高的毒副作用发生率，如严重膀胱刺激症状、高热、败血症、膀胱挛缩等，这极大地限制了其在临床上的广泛使用。因此，改造BCG菌株以提高其防治肿瘤的效果，同时减少其应用剂量与毒副作用是目前研究的热点。采用基因工程技术构建重组卡介苗(recombinant BCG，rBCG)，增强BCG的免疫活性和抗瘤能力，被认为是目前膀胱肿瘤免疫治疗中最有发展潜力的治疗方法。既往的研究已证实，细胞因子人干扰素α-2b(interferon-alpha 2b，IFNα-2b)与BCG联合膀胱灌注可提高BCG的免疫活性和抗癌能力。但外源IFNα-2b存在应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂的缺点，且费用高昂。因此，通过基因工程技术，将IFNα-2b基因重组入BCG，构建能自动表达IFNα-2b的rBCG，有望提高BCG抗膀胱癌疗效、降低BCG的应用剂量与毒副作用。二、研究目的通过基因重组技术，构建能自动表达人IFNα-2b的重组卡介苗(rBCG-IFNα-2b)，并通过与人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和人膀胱癌细胞株的作用，了解其与普通BCG相比，是否具有更强的免疫活性和抗癌作用，为提高BCG抗膀胱癌疗效、降低副作用提供科学依据。三、研究内容和方法1、卡介苗穿梭表达载体的构建与鉴定：采用多聚酶链反应(PCR)分别扩增人IFNα-2b和BCG Ag85B信号肽基因序列后，利用DNA重组技术将以上两个片段先后插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b并转化大肠杆菌(E．coli)，经抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFNα-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定。2、重组卡介苗rBCG-IFNα-2b的构建：利用电穿孔技术将pMV261-Ag85B-IFNα-2b导入BCG，构建rBCG-IFNα-2b并大量制备，分别用PCR扩增和Western blotting检测rBCG-IFNα-2b中目的基因的表达情况，酶联免疫吸附(ELISA)检测rBCG-IFNα-2b培养上清中IFNα-2b蛋白的表达情况。3、重组卡介苗rBCG-IFNα-2b抗膀胱癌细胞作用的研究：将rBCG-IFNα-2b作用于PBMC，观察PBMC的增殖情况；将经rBCG-IFNα-2b刺激的PBMC作用于人膀胱癌细胞株T24、T5637，了解其与普通BCG等对照组相比，对膀胱癌细胞的杀伤情况。四、结果1、经酶切、PCR和DNA测序鉴定，证实所克隆的BCG Ag85B信号肽DNA片段和人IFNα-2b片段与文献结果完全一致，pMV261-Ag85B-IFNα-2b的连接方向正确，阅读框与预期一致。2、利用电穿孔技术成功构建rBCG-IFNα-2b：以rBCG-IFNα-2b质粒DNA为模板，通过PCR扩增得到IFNα-2b的基因片段；Western blotting证实rBCG-IFNα-2b在蛋白水平目的基因可高效、稳定的表达，ELISA检测只在rBCG-IFNα-2b培养上清中检测到高表达的IFNα-2b蛋白为301.45pg／ml。3、rBCG-IFNα-2b可明显刺激人PBMC增殖，并随刺激浓度的增加，PBMC的增殖水平也增加，且这种刺激作用迅速，在刺激的第1天，PBMC即有明显增殖，并在刺激后3d PBMC增殖达到高峰。4、与普通BCG相比，rBCG-IFNα-2b激活的人PBMC对人膀胱肿瘤细胞株T24、T5637具有更强的杀伤作用，差异有显著性意义(P＜0.01)。五、结论1、正确构建了卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFNα-2b。2、利用电穿孔技术成功构建分泌人IFNα-2b的重组卡介苗rBCGIL-IFNα-2b，并在培养液中获得高效、稳定的表达。3、rBCG-IFNα-2b可明显刺激人PBMC增殖，且这种刺激作用迅速，在刺激的第1天，PBMC即有明显增殖，并在刺激后3d PBMC增殖达到高峰。4、与普通BCG相比，rBCG-IFNα-2b激活的人PBMC具有更强的对人膀胱癌细胞T24和T5637的杀伤作用，提示rBCG-IFNα-2b有望成为防治BTCC的一种更好的免疫制剂。