制备转基因动物的研究方法目前已有很多，而选择最合适的基因导入方法是成功制备转基因动物的关键。本实验以日本大耳白兔为实验动物，用精子载体法进行了转基因动物的研究，并分析了该方法的优缺点及成功率。 研究所用的重组质粒载体为反转录病毒载体pLNCXHLF。其中主要构建元件包括：启动子序列(山羊β-乳球蛋白基因5’端调控区)；外源基因(人乳铁蛋白基因cDNA)；标记基因(氨苄青霉素基因)；缺陷型逆转录病毒基因组。 通过(1)睾丸注射法既对生殖干细胞中未成熟精子进行转染；(2)输精管注射法既对成熟精子进行转染；(3)将精子在体外与外源DNA共孵育后，进行体外受精再胚胎移植的三种途径对对转基因动物进行研究，取得如下研究结果： 1．重组质粒用脂质体包裹后，注入雄兔睾丸组织中侵染生殖干细胞，自然受精后可以产生转基因兔，实验共设A、B、C、D、E与对照组六组，共获得转基因仔兔31只，72小时后，剪取尾尖，提取组织DNA，PCR检测，其中用外源基因设计的引物检测时，转基因阳性率为35％，用筛选基因设计的引物检测时，转基因阳性率为28％，此法所得转基因动物阳性率相对较高，而且雄体的这种能力保持的时间很长(注射后七个月，仍可通过PCR的方法从睾丸、附睾及输精管的精子里检测出外源基因)。然而，我们也看到，在后代检测中，利用不同的引物扩增重组质粒不同部位时，检测结果存在差异，转基因阳性率不同，这种差异说明当外源基因进入到异源细胞内，在重组整合时发生了外源基因丢失的现象，并由此导致外源基因的整合率下降，也可能是受细胞内核酸酶的作用，使得外源基因遭到降解。 2．重组质粒用脂质体包裹后，注人输精管中侵染其中的成熟精子，自然受精后也可产生转基因兔，实验共获得转基因仔兔4只，PCR检测转基因阳性率较高，用两种引物检测结果相同。 3．在本项工作中，同时进行了体外受精的研究。利用体外培养的方法，将卵巢中卵泡内的未成熟卵培养至成熟期；取出附睾内成熟精子，转染后体外获能，并对成熟卵进行体外受精，受精卵经体外培养后，已发育至桑葚胚。