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真菌可以通过有性和无性的方式进行繁殖,但约五分之一的真菌未发现有性生殖,称为半知菌。很多半知菌和具有性阶段的真菌亲缘关系很近,暗示着半知菌是因为各种原因,其有性阶段尚未被发现。
捕食线虫真菌是圆盘菌的无性型之一,其中弯孢节丛孢(Arthrobotrys musiformis)和椭圆亚隔指孢(Dactylellina ellipsosporum)既能通过分生孢子萌发的方式获得,也能通过子囊孢子萌发的方式获得。后一种方法得到的无性型培养物中,常常发现零星的子囊盘。但是,从分生孢子萌发得到的无性型培养物却没有发现子囊盘的产生。那这两种方法分离得到的菌株有性生殖相关基因是否发生了突变呢?
本文以两种方法分离到的弯孢节丛孢和椭圆亚隔指孢作为研究材料,分析同个物种内交配型基因和与有性生殖相关的基因是否发生了变异,而导致了从分生孢子萌发得到的培养物不能产生子囊盘,从而对半知菌缺乏有性生殖的原因进行初探,并给相应假说提供实验证据;同时还探讨了与有性生殖相关基因作为系统学研究分子标记的可能性。
论文的主要研究结果如下:
1.从1720份土样中分离到椭圆亚隔指孢和弯孢节丛孢各16株;从约4000份腐木标本的圆盘菌上共分离到椭圆亚隔指孢和弯孢节丛孢各4株和12株;
2.通过对11个与有性生殖相关基因的初筛,筛选出4个基因作为系统学分析的候选基因,分别是转录延长因子AS4,G蛋白α亚基gan-1,核苷二磷酸激酶ndk-1和有性生殖和减数分裂的负调控因子ran1,这些基因分别在弯孢节丛孢,少孢节丛孢,坚粘孢亚隔指孢,叶状枝节丛孢,蠕虫节丛孢,奇妙节丛孢,环捕德氏霉和白色亚隔指孢8个种中成功克隆和测序。通过NJ树的构建,发现其结果与捕食线虫真菌基于其他系统学分析常用标记的结果是一致的,说明AS4,gna-1,ndk-1和ran1基因都可以作为分子系统学研究的新标记。
3.为了分析已报道的与有性生殖相关基因在捕食线虫真菌中是否对其进行有性生殖的过程产生影响,信息素受体pre-1,抑制一般氨基酸控制所需的WD重复蛋白cpc-2,细胞分化蛋白rcd1,COP9信号小体亚基csnD,有性生殖和减数分裂的负调控因子ran1和决定性别的交配型基因sexM分别在椭圆亚隔指孢和弯孢节丛孢中成功克隆和测序。根据获得的与有性生殖相关的基因序列构建了MP树,只有在根据椭圆亚隔指孢的ran1基因序列构建的MP树中,分离自分生孢子的无性型与分离自圆盘菌的无性型完全分开。通过比对后发现,在椭圆亚隔指孢ran1的核苷酸序列中找到了33个分化位点,在其氨基酸序列中找到了8个分化位点,其核苷酸和氨基酸在不同分离源的菌株中发生了分化。通过遗传分化分析,同样也是椭圆亚隔指孢的ran1基因在两种不同分离源的群体内分化程度最高。因此,ran1基因在决定椭圆亚隔指孢能否进行有性生殖的过程中起关键作用。
4.分别将弯孢节丛孢和椭圆亚隔指孢的sexM基因序列进行了比对,发现sexM基因在椭圆亚隔指孢中能将两种分离源的群体分开。
本论文的创新主要体现在以下三个方面:
1.利用圆盘菌及其无性型作为研究材料,首次提供了半知菌丧失有性生殖的实验证据之一;
2.首次提出了AS4,gna-1,ndk-1和ran1基因可以作为分子系统学的研究标记;
3.利用圆盘菌及其无性型作为研究材料,首次发现交配型基因在两种分离源的群体中发生了分化。