论文部分内容阅读
为了获得更为适合工业应用的过氧化氢酶,本研究从高温环境中筛选耐热过氧化氢酶高产菌株,并对其进行发酵条行优化、过氧化氢酶分离纯化和酶学特性研究。论文主要研究结果如下:1、高温过氧化氢酶菌株筛选和鉴定。采用平板初筛和摇瓶复筛方法,从堆肥中筛选到一株高产过氧化氢酶菌株FZSF03,其初始酶活为1321U/mL。通过16S rRNA基因序列测序比对发现该菌株与标准菌株Ureibacillus thermosphaericus DSM10633的16SrRNA 基因序列同源性最高,为 99.37%,因此确定该菌株为嗜热解脲芽孢杆菌,命名为Ureibacillus thermosphaericus FZSF03。2、菌株FZSF03产酶发酵条件优化。通过单因素试验和正交试验确定了菌株产酶的最佳培养基为:酵母粉25g/L,麦芽糊精30g/L,CaCl2 1g/L。在此基础上,优化摇瓶产酶条件,确定其最佳培养条件为:培养基初始pH 7.0,培养温度55℃,装液量为60mL/250mL,接种量为6%(v/v),摇瓶发酵时间32h。最终产酶量达到41761 U/mL,较优化前酶活提高了 31.6倍。3、过氧化氢酶的分离纯化。通过DEAE-SepharoseTM FF离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤层析和疏水层析成功得到电泳纯的过氧化氢酶蛋白,使酶的比活力从43360 U/mg提高到219360 U/mg,纯化了 5.06倍,回收率为14.49%。通过SDS-PAGE电泳图得知该酶的亚基相对分子量约为57 KD,与质谱鉴定结果相符。4、过氧化氢酶学性质研究。考察了温度、pH对酶活性的影响,并测定了纯酶的Km值和Vmax,结果表明该酶的最适反应温度为60℃,在60℃下保温60 min有80%以上的剩余酶活,保温90min仍可保持70%以上的剩余酶活,稳定性良好;最适反应pH为7.0,在pH 5～10之间处理60 min仍有80%的剩余酶活,表现出良好的稳定性。过氧化氢酶与底物的之间的相互作用不符合常规的动力学方程,采用双倒数作图法计算出线性范围内酶的表观Km值为100mmol/L,Vmax为 3571 μmol/min。