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目的:宫颈癌是全球妇女第四大常见癌症。高危型人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）持续性感染是宫颈癌发生的主要危险因素。目前已经上市的HPV疫苗可有效保护机体免受HPV感染,进而预防宫颈癌的发生,但对于已发生的HPV感染及其所致疾病无法起到治疗作用。传统的宫颈癌治疗如手术、化疗和放疗由于创伤大、副反应严重以及部分患者预后较差等显示出多种局限性,因此探究全新的宫颈癌治疗模式势在必行。治疗性HPV疫苗可诱导机体产生抗原特异性的免疫应答,清除HPV感染细胞及病毒转化的恶性肿瘤细胞。课题组前期已经证实以Cp G ODN为佐剂、以HPV16 E7多肽为抗原的治疗性HPV疫苗单次接种对早期宫颈癌具有显著的治疗作用,但对于中晚期肿瘤抑制效果有限,其可能原因是较大体积的肿瘤局部存在更强的免疫抑制微环境。鉴于单一的HPV疫苗治疗中晚期宫颈癌的效果欠佳,故考虑加用免疫调节剂,以期改善肿瘤局部的免疫抑制环境,增强疫苗诱导的适应性免疫应答,进而抑制中晚期肿瘤生长。研究证实,天然来源的β-葡聚糖具有免疫调节活性,且安全性较高,因此可能增强肿瘤治疗性疫苗的抗瘤效果。本研究应用C57BL/6小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型,采用酵母β-葡聚糖与以Cp G ODN为佐剂的HPV16 E7多肽疫苗联合治疗的方式,探讨联合方案对中晚期宫颈癌的治疗效果及免疫机制。本研究结果将对于采用免疫调节剂来提高治疗性HPV疫苗的疗效提供重要依据,同时为中晚期宫颈癌的治疗提供新思路。研究方法:1.多肽合成。HPV16 E743-77多肽由35个氨基酸组成,其中包含两个CD4T表位和一个CD8T表位,其序列为GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLC VQSTHVDIR,纯度＞95%。2.荷瘤小鼠的免疫治疗。C57BL/6小鼠在第0天接种TC-1肿瘤细胞（5×10~5个/只）,在第11天肿瘤体积约100 mm~3时将荷瘤小鼠完全随机分成4组:磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）对照组、酵母β-葡聚糖（Yeast beta-glucan,Y-BG）组、疫苗组和联合治疗组。Y-BG组小鼠分组当日每天灌胃酵母β-葡聚糖（800μg/只）,持续2周;疫苗组小鼠分组4天后皮下接种以Cp G ODN为佐剂的HPV16 E7多肽疫苗（20μg Cp G ODN+50μg E7多肽）;联合治疗组小鼠进行灌胃并接种疫苗。3.评估联合治疗对中晚期肿瘤的抑制效果。实验期间每2-3天对小鼠一般状态,体重及肿瘤大小进行观察和记录,实验结束后绘制肿瘤生长曲线,称量肿瘤重量。4.检测联合治疗对脾脏内分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的影响。分离小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,应用流式细胞术检测CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞的百分比。5.检测联合治疗对肿瘤内DCs的影响。分离肿瘤组织,制备肿瘤细胞悬液,应用流式细胞术检测各组小鼠肿瘤组织中浸润性DCs的表面分子MHCII和CD86的表达。6.检测联合治疗对肿瘤内免疫抑制性细胞的影响。分离肿瘤组织,制备肿瘤细胞悬液,应用流式细胞术检测各组小鼠肿瘤组织中Tregs（CD4+Foxp3+）、TAMs（CD11b+F4/80+）和MDSCs（CD11b+Gr-1+）细胞的百分比。7.检测联合治疗对肿瘤中的细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶表达水平的影响。应用RT-q PCR检测肿瘤组织中的细胞因子（IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α、VEGF、TGF-β）、趋化因子（CCL2、CCL20、CXCL10、CXCL14）和基质金属酶（MMP2、9）的m RNA水平。8.统计学分析。应用Graph Pad Prism软件进行统计学分析,P＜0.05表示有统计学差异。结果:1.酵母β-葡聚糖与以Cp G ODN为佐剂的HPV16 E7多肽疫苗联合应用能够抑制小鼠中晚期宫颈癌生长。与PBS对照相比,联合治疗显示了显著的协同作用,能有效抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,肿瘤体积和重量均显著降低（P＜0.05）。2.联合治疗能增加脾脏中分泌IFN-γ的CD4+的数量。与PBS对照相比,联合治疗使小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞占比明显升高（P＜0.05）,CD8+IFN-γ+T细胞也有所增加,但差异未达到统计学意义。3.联合治疗能增加肿瘤内DCs表面分子的表达。与对照组相比,联合治疗使小鼠肿瘤组织中浸润性DCs的表面分子MHCII表达水平显著升高（P＜0.05）,CD86分子表达也有所升高,但无统计学差异。4.联合治疗能改善肿瘤内免疫抑制性细胞的数量。联合治疗能够使小鼠肿瘤组织中Tregs（P＜0.05）百分比显著降低,TAMs和MDSCs的百分比没有明显差异。5.联合治疗能改变肿瘤内多种细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的m RNA水平。RT-q PCR结果显示,与PBS组相比,联合治疗组小鼠肿瘤组织内IL-2（P＜0.01）、IL-12（P＜0.001）、IFN-γ（P＜0.001）、TNF-α（P＜0.001）等抗肿瘤细胞因子表达水平显著升高,而IL-10（P＜0.05）、VEGF（P＜0.001）和TGF-β（P＜0.05）等免疫抑制分子表达水平显著降低,CXCL10（P＜0.001）和CXCL14（P＜0.05）表达水平显著上升,CCL2（P＜0.01）、CCL20（P＜0.05）、MMP2（P＜0.05）、MMP9（P＜0.05）表达水平显著下降。结论:1.联合治疗可抑制小鼠中晚期宫颈癌的生长。2.联合治疗能增加小鼠脾脏中分泌IFN-γ的CD4+T细胞,减少肿瘤组织中Tregs细胞数,增加肿瘤浸润性DCs表面分子MHCII的表达。3.联合治疗通过改变肿瘤组织中多种细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶的水平,改善肿瘤内免疫抑制微环境,增强机体的抗肿瘤免疫应答。