【摘 要】
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非结构蛋白NS1是由A型流感病毒编码的一个重要的病毒因子,通过与宿主细胞内多种蛋白相互作用而影响病毒的致病性和毒力,并通过自身的多功能调节宿主细胞凋亡。本实验室在前期
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非结构蛋白NS1是由A型流感病毒编码的一个重要的病毒因子,通过与宿主细胞内多种蛋白相互作用而影响病毒的致病性和毒力,并通过自身的多功能调节宿主细胞凋亡。本实验室在前期研究中采用噬菌体展示技术筛选到与禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白相互作用的宿主蛋白NOLC1,并采用基因截短技术、His-pull down、PCR定点突变等技术确定了NS1-NOLC1相互作用的最小区域是NS1效应域(ED)末端第104-200位氨基酸所组成的蛋白区域,该区域第120位天冬氨酸D和第195位精氨酸R是参与NS1-NOLC1相互作用的关键位点。为了研究120-D和195-R在NS1-NOLC1相互作用过程中的协同作用,本研究采用PCR定点突变技术对120D和195R两个位点进行了双点突变,构建GFP-NS1-ED(D120A/R195A)双点突变真核表达载体,转染COS-7细胞获得突变体蛋白,并利用His-pull down技术确定NS1的各个突变蛋白与NOLC1相互作用,结果显示,NS1双点突变蛋白与NOLC1的相互作用减弱,与野生型NS1相比,减少了大约83%,说明NS1(ED)区域120D和195R这两个氨基酸位点在NS1-NOLC1相互作用过程中起到协同作用。在此基础之上,为了深入研究NS1-NOLC1相互作用的生物学功能,分别于A549细胞中转染GFP-NS1全长表达质粒、GFP-NS1-ED(D120A/R195A)双点突变质粒,过表达载体质粒GFP-NOLC1和干扰表达质粒shRNA-NOLC1,采用Hochest33342染色和AnnxinV-APC/PI双染流式细胞术定性定量检测A549细胞凋亡情况,结果显示,转染NS1全长质粒的A549细胞凋亡率为65.5%,而转染双点突变NS1(120D/195R)的A549细胞凋亡率为29.7%,从实验结果可以看出,NS1(120D/195R)双点突变蛋白与全长NS1蛋白相比,细胞凋亡率降低;过表达和干扰表达NOLC1的A549细胞的凋亡率分别为56.4%和44.0%,这表明,A549细胞中NOLC1蛋白的的表达量与细胞的凋亡有着密切关系,过高或过低均会引起细胞发生凋亡,NS1与NOLC1相互作用很可能是NS1蛋白诱导宿主细胞凋亡的关键途径之一,需要进一步深入研究。本研究确定NS1(ED)区域120-D和195-R在NS1-NOLC1相互作用中的协同作用,并探索了NS1-NOLC1相互作用的生物学功能,为进一步研究两个蛋白的相互作用提供了理论依据,对解析禽流感病毒的致病机理提供了新的思路。
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