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目的:超极化激活环核苷酸门控通道(hyperpolarization-activation cyclic nucleotide-gated channel,HCN channel)是一类非选择性的阳离子通道。研究表明在哺乳类动物心脏上表达有HCN1、HCN2、HCN4三种通道亚型,其中HCN2、HCN4在正常情况下共同参与并维持心脏正常生理活动。HCN通道介导的起搏电流If为一类超极化激活电流,在心脏自主节律的形成和变时功能调节等方面发挥着重要的生理及病理生理学功能。采用模型细胞异源表达HCN通道,并成功记录到由该离子通道介导的超极化激活电流,从而证实该电流的分子基础为HCN通道蛋白。心房颤动(Atrial Fibrillation,AF),简称房颤,是临床最常见的快速型心律失常之一。大量研究显示,相对于窦性心律患者,房颤患者心房肌组织中HCN通道表达异常增加,因此推测HCN通道可能是房颤治疗的一个新靶点。伊伐布雷定(Ivabradine,Iva)是一种If电流的选择特异性阻滞剂,目前适用于慢性稳定性心绞痛、心力衰竭等心血管疾病的药物治疗。临床研究表明,伊伐布雷定可降低快速型心律失常的发生率及持续时间,但具体作用机制仍未阐明。本实验拟在新生大鼠心房肌细胞上建立快速起搏模型,探讨伊伐布雷定对HCN通道的表达及功能的影响,进而改善心房肌细胞凋亡水平,减轻房颤状态下心房结构重构,为该药在抗房颤的药物治疗方面提供更多的实验证据。方法:(1)原代新生大鼠心房肌细胞分离及培养:选取出生1~3天的Sprague Dawley(SD)大鼠。在相对无菌环境下,固定乳大鼠的四肢,于胸骨剑突下开胸,完全暴露心脏后,使用无菌镊子夹取完整心脏放入盛有无菌PBS的P6培养皿中,挤压心腔中残留血液后,将心脏转移至新的培养皿中,分离出左、右心耳,收集并转移心耳组织至T25玻璃培养瓶中,加入0.25%胰蛋白酶2 ml,静置于4℃环境,14~16 h后终止胰蛋白酶的消化。继续用II型胶原酶消化液在37℃水浴条件下消化5~10 min,离心后收集心房肌细胞并接种于P10培养皿,放置于37℃、5%CO2培养箱进行差速贴壁,收集细胞悬液均匀接种于P6培养皿或者6孔板,细胞个数约1×104/cm2,并加入成纤维细胞抑制剂5-Brdu(终浓度:100μM),于37℃、5%CO2培养箱培养,24 h后倒置相差显微镜观察,细胞贴壁良好,更换新的完全培养基,以备后续实验使用。(2)进行心肌细胞鉴定。将心房肌细胞随机分为4组:对照组(Control):完全培养基正常培养;药物干预组(Iva):在培养基中加入终浓度为10μM的Ivabradine;电刺激组(Pacing):建立快速起搏模型,给予心房肌细胞强度10 V、频率10 Hz、时长24 h的持续电刺激;电刺激干预组(Pacing+iva):在给予心房肌细胞同条件电刺激的同时加入终浓度10μM Ivabradine进行药物干预;(3)Real-Time PCR检测各组m RNA、micro RNA表达差异:1)提取心房肌细胞中的总RNA,260/280均在1.8~2.0之间;继而采用逆转录试剂盒,将已提取出的心房肌总RNA逆转录为c DNA,采用SYBR Green I法Real-Time PCR检测各组间HCN2、HCN4 m RNA水平的差异。2)使用mir Vana TMmi RNA Isolation Kit试剂盒提取心房肌细胞micro RNA,按照All-in-One TMmi RNA q RT-PCR试剂盒检测各组micro RNA-1、micro RNA-133的表达差异。(4)Western blotting实验:RIPA(含蛋白酶抑制剂)提取心房肌细胞总蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白质浓度,变性备用。取心房肌细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳,然后将蛋白转移至PVDF膜上,室温封闭2 h,一抗4℃孵育过夜,二抗常温孵育1 h后,运用Bio-Rad凝胶成像处理系统检测蛋白条带,采用Quantity One软件分析各组间HCN2、HCN4以及凋亡诱导因子(Apoptosis-inducing factor,AIF)的蛋白表达差异。(5)流式细胞术(Flow Cytometry,FCM):采用凋亡试剂盒,按照说明对各组心房肌细胞进行处理,流式细胞仪对各组心房肌细胞进行凋亡细胞检测。(6)全细胞膜片钳实验:于倒置相差显微镜下选择立体感好、折光性强的单个心房肌细胞进行If电流记录。结果:(1)Real-Time PCR实验:1)Iva组较Control组HCN2 m RNA表达量上调(n=6,P<0.01),HCN4 m RNA表达量上调(n=6,P<0.05);Pacing组较Control组HCN2 m RNA表达量上调(n=6,P<0.01),HCN4 m RNA表达量上调(n=6,P<0.05);Pacing+iva组较Pacing组HCN2 m RNA表达量下调(n=6,P<0.05),HCN4 m RNA表达量下调(n=6,P<0.05);2)Iva组较Control组micro RNA-1表达量下调(n=6,P<0.01),micro RNA-133表达量下调(n=6,P<0.01);Pacing组较Control组micro RNA-1表达量下调(n=6,P<0.01),micro RNA-133表达量下调(n=6,P<0.01);Pacing+iva组较Pacing组micro RNA-1表达量上调(n=6,P<0.01),micro RNA-133表达量上调(n=6,P<0.01)。(2)Western blotting实验:Iva组较Control组HCN2通道蛋白表达量上调(n=5,P<0.01),HCN4通道蛋白表达量上调(n=5,P<0.01),AIF表达无明显差异(n=5,P>0.05);Pacing组较Control组HCN2通道蛋白表达量上调(n=5,P<0.01),HCN4通道蛋白表达量上调(n=5,P<0.01),AIF表达量明显增加(n=5,P<0.01);Pacing+iva组较Pacing组HCN2通道蛋白表达量下调(n=5,P<0.01),HCN4通道蛋白表达量下调(n=5,P<0.01),AIF表达量显著下降(n=5,P<0.01)。(3)流式细胞术(Flow Cytometry,FCM):Iva组较Control组心房肌细胞早期凋亡率无明显变化(n=5,P>0.05);Pacing组较Control组心房肌细胞早期凋亡率显著升高(n=5,P<0.01);Pacing+iva组较Pacing组心房肌细胞早期凋亡率明显下降(n=5,P<0.01)。(4)全细胞膜片钳实验:膜电位为-150 m V时,Iva组较Control组,心房肌细胞If电流密度显著减小:-4.83±1.97p A/p F Vs.-12.49±3.26 p A/p F(n=6,P<0.01);Pacing组较Control组,心房肌细胞If电流密度增大:-17.32±2.73 p A/p F Vs.-12.49±3.26 p A/p F(n=6,P<0.05);Pacing+iva组较Pacing组,心房肌细胞If电流密度明显减小:-5.05±2.27 p A/p F Vs.-17.32±2.73 p A/p F(n=6,P<0.01)。结论:(1)胰蛋白酶联合II型胶原酶消化法,培养的心房肌细胞数量多,贴壁好,具有良好心肌细胞电生理特性,可供后续分子生物学实验和电生理研究使用;(2)成功建立了新生大鼠心房肌细胞快速起搏模型,该模型可用于模拟房颤的病理状态;(3)HCN2、HCN4通道的表达及功能改变与房颤致心房肌细胞凋亡相关;(4)伊伐布雷定通过抑制HCN2、HCN4通道基因、蛋白的表达,抑制起搏电流If幅度,降低心房肌细胞的凋亡率,减轻房颤所致的心房肌结构重构。