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器官移植已经成为患终末期器官功能衰竭病人的有效治疗手段，但是免疫排斥反应仍然是器官移植的主要障碍之一。目前所用的免疫抑制疗法，虽然能有效地预防急性排斥反应，但是对于慢性排斥反应还是无济于事。同时，受体还面临着许多危险，如机会性感染、继发性糖尿病、高血压、肾功能损害和继发性恶性肿瘤等。此外，受体在移植后必须终生服用免疫抑制剂，存在沉重的经济负担。因此，诱导移植物免疫耐受是当前器官移植领域的研究热点。 IL-10是一种细胞因子合成抑制因子，由多种不同的细胞所生成的，如激活的T细胞、B细胞、单核细胞等。IL-10负调节多种免疫反应，通过抑制IL-2的生成和下调APCs的ClassⅡMHC和B7分子，直接或间接地抑制T细胞的增殖和分化。IL-10作用于CD4+T细胞，导致调节性T细胞亚群的生成，诱导T细胞的长期无能。IL-10抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF等炎症因子的产生，有很强的抗炎症作用。EB病毒编码的vIL-10与hIL-10和mIL-10有高度的同源性，享有hIL-10和mIL-10的许多免疫抑制的活性，但缺乏对T细胞、B细胞等的协同刺激功能，因此，vIL-10是一种抑制同种移植免疫反应的理想候选细胞因子。 造血干细胞有很强的自我更新和分化生成各种细胞系的功能，所以造血干细胞是基因治疗的理想靶细胞。在理论上，通过把治疗基因导入多能的造血干细胞就能取得长期的治疗效果，因为少量经过遗传工程修饰的造血干细胞能分化生成大量携带有治疗基因的各种血细胞。 以小鼠白血病病毒为基础的逆转录病毒载体能够稳定地将目的基因整合到靶细胞基因组中，允许将目的基因递呈到其子代细胞，对宿主的安全性好。 本课题研究依据是建立在vIL-10的免疫抑制活性、造血干细胞的自我更新和分化功能、逆转录病毒载体的生物学特性的基础上。选用MSCVneo逆转录病毒表达系统和vIL-10cDNA，构建MSCVneo-vIL-10重组体，在体外转导造血干细胞，回输入经致死照射的同基因小鼠，用ELISA监测vIL-10在体内的表达情况。8周后，选用vIL-10表达阳性的小鼠作为受体，进行同种异位心脏移植，评估移植心脏生存时间，组织病理学变化，细胞因子的表达和淋巴细胞浸润的变化，探讨vIL-10诱导心脏移植免疫耐受的可能机制。第二军医大学博士研究生论文 本实验分为三个部分 第一部分小鼠腹部异位心脏移植模型的建立 异氟醚持续吸入麻醉，动物为8一12周龄的cBA(H一2勺小鼠。采用ono，S手术方式在外科手术显微镜下（16一25x）单人完成。摘除的供体心脏仅保留升主动脉和肺动脉。用11一0无创伤缝线在受体肾血管开口水平以下，将供体升主动脉与受体腹主动脉、供体的肺动脉与受体下腔静脉分别行端侧吻合。共施行小鼠腹部异位心脏移植20例，供体心脏切取平均时间为18士3分钟，血管吻合平均时间为35士5分钟，受体平均手术时间为70士巧分钟。手术成功17例，术后存活20天以上，成功率达85%。 第二部分逆转录病毒介导转vIL一10基因入造血干细胞在体内的表达 1.用EcoRI酶切含有全长vlL一10 cDNA的pBCRFI质粒，得到0.skb的vIL一10cDNA片段，用EcoRI酶切开MSCVneo载体，然后用T4DNA连接酶将o.skb vIL一10片段克隆入MscVne。的多克隆位点。用MSCVneo一vIL一10转染感受态的大肠杆菌并接种到Ampicillin琼脂培养基，选择正确连接方向的阳性克隆株，进行质粒DNA的制备、纯化。DNA测序再证实连接的vIL一10序列是正确的。 2.用标准的磷酸钙沉淀法将MSCVneo一vIL一10或MSCVneo Vector转染双嗜型包装细胞pT67，用G4 25筛选出阳性克隆株。 3.用末端稀释法测定MSCVneo一vIL一10或MSCVneo Vector转染的包装细胞PT67阳性克隆株的病毒滴度。 4.用免疫磁珠法从6周龄，重20一259的cBA（H一ZK）小鼠的胫骨和股骨骨髓中分离、纯化造血干细胞并进行流式细胞分析。 5.转导和移植HSCs ①将HSCS接种在含有IL一3和SCF的无血清培养基中预刺激48小时，②用PT67MSCVneo一vIL一10或PT67 MSCvneo Vector培养了48小时，含有高滴度病毒颗粒的上清液转导HSCS，连续2天，每天6小时，并离心2小时，次日收集并洗涤HSCs。③给每个经致死量照射的同基因cBA小鼠注入2 xl护Hscs。 结果:1.双嗜型包装细胞PT67的阳性克隆株能稳定产生高滴度的无复制能力病毒颗粒，sxlo6一8又lo6eFu/ml。2.从每个eBA小鼠可富集得到l，o又106一l.6xlo6HSes。其中45.4一55.50，0为eD34+seal+。3.southem blotti雌证实vIL一10 eDNA能整合到HsCs的基因组中，4.ELISA检测示:vIL一10在体内能稳定，持续表达6个月，血清浓度在270 pg/ml一1340Pg/mlO 6.RI’- PCR和Westem blotting证实小鼠的多个器官均有vlL一10的RNA和蛋白的表达。第二军医大学博士研究生论文 第三部分vIL一10转基因对小鼠同种异位心脏移植免疫耐受的实验研究 实验分为4组:I组，受体无任何处理;11组受体动物为移植无病毒转染HSCss周后:111组受体动物为移植MSCVneo转染HSCss周后;IV组受体动物为移植MSCVneo一vIL一10转染HscSS周后，该组动物血清vIL一10阳性。以c57Bu6（H一Zb），J、鼠作为供体与上述各组受体?