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背景及目的:心肌纤维化（Myocardial fibrosis,MF）是多种心血管系统疾病如缺血性心肌病、心肌病、瓣膜性心脏病等发展至终末阶段共同的病理生理改变,其中,心脏成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）的过度增殖和细胞外基质的积累是形成心肌纤维化的病理基础之一。心肌纤维化不但可以影响心脏收缩和舒张功能,其引起的心脏结构重构也是导致心律失常的原因之一,对患者和其家庭造成了心理与经济负担。国内外研究表明,NLRP3炎症小体的激活与心肌纤维化密切相关。TLR4是NLRP3炎症小体的上游因子,可以通过依赖性My D88通路诱导炎症分子基因编码。因此,本研究提出以下理论假设:在CFs增殖发展至心肌纤维化的过程中,TLR4可能通过调节NLRP3炎症小体的活化,从而参与调控CFs增殖及纤维化。本实验通过体外血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导CFs纤维化模型,利用TLR4-shRNA转染CFs,观察TLR4-shRNA对CFs增殖及胶原合成的影响,并检测NLRP3炎症小体的表达,探讨TLR4-shRNA调节NLRP3炎症小体在CFs增殖中的作用,研究结果可望为治疗MF提供理论依据。方法:1.SD乳鼠原代CFs分离、培养和鉴定分离SD乳鼠心脏,用胰酶及Ⅱ型胶原酶消化心脏组织,差速贴壁法获得心脏成纤维细胞,通过普通光学显微镜观察和免疫荧光检测波形蛋白表达对心脏成纤维细胞进行鉴定。2.AngⅡ刺激CFs构建体外心肌纤维化模型用不同浓度(0mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L)AngⅡ作用于CFs,CCK-8试剂盒检测检测细胞的增殖率,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测CollagenⅠ/Ⅲ的m RNA和蛋白表达。3.TLR4-shRNA对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响实验分为四个组:Control组,AngⅡ组,AngⅡ+vehicle,AngⅡ+TLR4-shRNA组。Control组不作处理,AngⅡ组予以10-6 mol/L的AngⅡ刺激,AngⅡ+vehicle及AngⅡ+TLR4-shRNA组分别转染vehicle及TLR4-shRNA 3天后再予以AngⅡ刺激。采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖率。4.TLR4-shRNA对NLRP3炎症小体和心脏成纤维细胞胶原表达的影响电子透射显微镜观察各组细胞内细胞器的变化,实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测各组细胞TLR4、NLRP3、Caspase-1、TGF-β及CollagenⅠ的m RNA和蛋白表达。结果:1.SD乳鼠原代CFs分离、培养和鉴定普通光学显微镜下观察,CFs多为三角形或星形,一般含有2～3个细胞核,核呈卵圆形,较大且多居中,胞质透明。细胞贴壁状态为放射状贴壁,无自发性搏动,随着细胞融合度的增加,逐渐变为梭形;免疫荧光结果显示波形蛋白表达阳性,证实分离培养的细胞为心脏成纤维细胞。2.AngⅡ刺激CFs构建体外心肌纤维化模型CCK-8结果显示,AngⅡ处理24h后,在浓度为10-6mol/L时对心脏成纤维细胞刺激增殖最明显（P＜0.05）;实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹结果显示,与Control组比较,AngⅡ组的Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）,Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）的m RNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）,证实体外心肌纤维化模型成功建立。3.TLR4-shRNA对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞增殖的影响CCK-8结果显示,与Control组比较,AngⅡ组、AngⅡ+vehicle组和AngⅡ+TLR4-shRNA组的心脏成纤维细胞增殖明显（P＜0.05）;与AngⅡ+vehicle组比较,AngⅡ+TLR4-shRNA组的心脏成纤维细胞增殖下降（P＜0.05）。4.TLR4-shRNA对NLRP3炎症小体和心脏成纤维细胞胶原表达的影响透射电子显微镜结果显示,四组细胞之间的差异性主要体现在线粒体内质网肿胀扩张的程度,以及胞内自噬溶酶体相关结构的数量多少。其中,AngⅡ组细胞胞质内细胞器较少,且存在大量疑似自噬形成的空泡,线粒体存在轻中度肿胀,相较其它组而言受损最为严重,而相对于AngⅡ组,AngⅡ+TLR4-shRNA组的损伤减轻。实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹结果显示,与Control组比较,AngⅡ组的TLR4、NLRP3、Caspase-1、TGF-β、CollagenⅠ的m RNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）;与AngⅡ+vehicle组比较,AngⅡ+TLR4-shRNA组的TLR4、NLRP3、Caspase-1、TGF-β、CollagenⅠ的m RNA及蛋白表达均降低（P＜0.05）。结论:TLR4-shRNA可以降低NLRP3炎症小体及TGF-β、CollagenⅠ的表达,并抑制AngⅡ诱导心脏成纤维细胞的增殖。