论文部分内容阅读
目的:胆囊结石是严重影响人们健康和生活质量的疾病。由于饮食结构的改变,胆囊结石的发病率明显升高。尽管胆石成因的研究有了较大进展,但其形成机制仍不十分明了。国内外学者对此进行了大量研究,发现胆囊浓缩功能增强,胆汁中胆固醇、钙离子及粘蛋白等促成石成份浓度增高是结石形成的重要诱因。然而,胆囊本身作为与疾病发生和发展有密切关系的器官,其重要性并未引起足够的重视。胆囊是储存和浓缩胆汁的器官,其粘膜有很强的浓缩功能。胆囊胆汁的浓缩过程主要通过离子与水的吸收来实现,在此过程中Na+/H+交换蛋白3(Na+/H+exchanger isoform 3,NHE3)起着重要的作用。NHE是表达于粘膜上皮细胞的离子转运蛋白,其功能是将细胞外的Na+转运至胞内同时排出等量的H+,在调节水电解质和酸碱平衡中发挥重要作用。在胆囊上皮细胞,NHE3向细胞内转运Na+形成细胞内外的渗透压梯度,水分子则顺渗透压梯度进入细胞使胆囊内胆汁浓缩。来自Narins的一项重要研究结果表明,胆囊结石形成前期胆囊粘膜浓缩增强,NHE3的活性增高,而采用NHE3抑制剂amiloride则可以明显抑制粘膜吸收并降低结石形成率。该研究提示,NHE3功能增强导致胆囊浓缩增加是结石形成的重要诱因。但令人遗憾的是,胆囊上皮细胞NHE3活性调节机制及其功能失调在结石形成中的作用尚属未知。我们在以往研究基础上提出致石饮食导致的NHE3功能异常是胆囊浓缩功能增强的重要诱因。因此,本博士论文拟对胆囊胆固醇结石形成过程中NHE3功能失调的分子机制展开研究。研究方法:本研究以高胆固醇饮食构建C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石模型。采用RT-PCR检测正常饮食组以及致石组胆囊粘膜NHE3基因在转录水平的差异;采用Western blot检测两组胆囊粘膜NHE3蛋白的表达情况;采用免疫荧光检测胆囊组织中NHE3细胞内定位情况。为进一步研究胆固醇结石形成后NHE3活性失调的机制,我们采用Western blot检测两组胆囊粘膜PKCα、NHERF1以及ezrin蛋白的表达情况;采用免疫共沉淀检测NHE3与ezrin以及NHERF1的相互作用情况。为探索胆囊结石形成前期导致NHE3活性增强的分子机制,我们以鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)和/或forskolin刺激胆管癌细胞,采用Western blot检测CDCA和/或forskolin对NHE3、PKCα以及ezrin蛋白的表达影响;采用免疫共沉淀检测CDCA对NHE3与ezrin相互作用的影响。结果:结果显示,正常饮食组C57BL/6鼠胆囊胆汁清亮,呈现淡黄色,无结石形成,成石率为0。致石组所有C57BL/6鼠胆囊胆汁稠厚,可见颗粒状结石,呈黄白色,多发,成石率为100%。RT-PCR显示胆固醇结石组小鼠胆囊组织中NHE3基因的转录水平显着高于正常组(P<0.05)。与正常组相比,致石组小鼠的胆囊组织中总NHE3在蛋白表达水平没有明显差异。NHE3在蛋白质和基因转录水平之间的差异可能是蛋白质的稳定性下降或NHE3 mRNA翻译减少的结果。因为磷酸化可以影响NHE3的转运活性,我们进一步检验了PS552-NHE3的水平。我们发现致石组小鼠胆囊组织中NHE3的磷酸化水平显着高于正常组(P<0.05),与胆囊粘膜浓缩功能异常的现象吻合。胆囊粘膜的单层柱状上皮细胞表达NHE3和PS552-NHE3。NHE3蛋白在顶膜和细胞质中均有表达,这与NHE3可以在细胞顶质膜与细胞内之间转运的报道一致。此外,致石组和正常组之间总NHE3蛋白表达没有显着差异。胆固醇结石胆囊组织中NHE3的磷酸化水平明显增高。这些结果与我们的western blot结果一致。致石组小鼠的胆囊组织中总ezrin表达水平没有明显差异,但是ezrin蛋白的磷酸化水平显著增高(P<0.05)。并且,PKCα以及NHERF1在蛋白表达水平增高(P<0.05)。用NHE3抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过ezrin抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHE3免疫沉淀复合物中含有ezrin蛋白。用ezrin抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHE3抗体进行免疫印迹分析。结果表明,ezrin免疫沉淀复合物中含有NHE3蛋白。用NHE3抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHERF1抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHE3免疫沉淀复合物中含有NHERF1蛋白。用NHERF1抗体与胆囊粘膜上皮细胞总蛋白进行免疫沉淀,转膜后通过NHE3抗体进行免疫印迹分析。结果表明,NHERF1免疫沉淀复合物中含有NHE3蛋白。上述免疫共沉淀实验显示NHE3能够与NHERF1以及ezrin结合并形成蛋白复合体。在PKA激动剂forskolin的协同作用下,CDCA可以明显增强NHE3活性抑制因子PKCα的表达(P<0.05),并活化细胞骨架连接蛋白ezrin(P<0.05)。同时,CDCA能够促进ezrin与NHE3形成蛋白复合体。结论:高胆固醇饮食诱导的C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石这一动物模型成石率高并且经济可靠,可用于胆石成因的实验研究。胆囊结石形成后NHE3的磷酸化水平增高,与胆囊浓缩功能减退的现象相吻合,同时也提示NHE3功能异常与PKA信号通路活性的异常有关。在胆囊粘膜上皮细胞,NHE3同时表达于细胞膜和胞质内,这提示NHE3在细胞内的转运是调节其离子交换活性的重要机制。胆囊结石形成后粘膜浓缩功能减弱可能与ezrin,PKCα以及NHERF1表达异常导致的NHE3功能紊乱有关。胆囊组织中NHE3蛋白复合物的形成是调控其离子交换活性的重要机制之一。胆囊粘膜浓缩功能异常很可能是其暴露于致石胆汁的后果。生理状态下,CDCA很可能对胆囊上皮细胞NHE3的活性具有抑制作用;致石胆汁中CDCA浓度减低可能是结石形成前期胆囊粘膜浓缩功能增强的重要诱因。通过本项目的系统研究,能够加深对胆囊结石发病机理的理解,为预防和治疗胆囊胆固醇结石提供理论依据和实验基础。