【摘 要】
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目的:探索半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）基因在骨髓源性间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）条件培养基抗转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）纤维化中涉及的可能调控新机制。方法:1.无菌条件下分离年轻SD大鼠（110～130g）股骨和胫骨,从中提取
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目的:探索半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）基因在骨髓源性间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）条件培养基抗转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）纤维化中涉及的可能调控新机制。方法:1.无菌条件下分离年轻SD大鼠（110～130g）股骨和胫骨,从中提取骨髓MSCs,并用含10%胎牛血清（10%FBS）的低糖DMEM培养基进行原代培养,按照1:3比例传代至P3代后,流式细胞表型鉴定,使用低糖DMEM（不含血清）培养基培养48 h,收集此时细胞上清,离心过滤,制备MSCs条件培养上清（Serum-Free MSCs Conditioned Medium,SFMSCs-CM）备用。2.用低糖DMEM（含10%FBS）的完全培养基培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,实验分为以下5组,对照组、TGF-β1组,TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组、TGF-β1+SF-DMEM（Serum-Free DMEM,无血清低糖DMEM）干预组以及单纯SF-MSCs-CM干预组。人重组TGF-β1（15 ng/m L）处理72 h建立纤维化模型,建模后的干预组分别用SF-MSCsCM和SF-DMEM处理24 h,SF-MSCs-CM组仅予正常细胞SF-MSCs-CM处理24 h。3.利用慢病毒载体转染NRK-52E细胞,建立Gal-3敲低（Gal-3 Knock Down,Gal-3 KD）和Gal-3过表达（Gal-3 Over Expression,Gal-3OE）工具细胞,分组及处理同前述。分别采用免疫细胞化学和免疫印迹法检测纤维化及自噬相关指标。结果:1.在正常培养的NRK-52E细胞中,与对照组进行比较,模型组中α-SMA、FN、Kim-1、Gal-3、Snail的蛋白表达水平与TIMP1/MMP9、P-Akt/Akt、P-GSK3β/GSK3β、P-PI3K/PI3K、P-m TOR/m TOR的比值明显升高,而EMT的标志E-钙粘蛋白（E-cadherin,E-cad）蛋白表达水平则明显降低（P＜0.05）;与模型组相比较,经TGF-β1+SF-MSCs-CM干预后,上述指标除了E-cad的蛋白表达水平升高以外,其余指标均明显降低（P＜0.05）;与TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组进行比较,TGF-β1+SF-DMEM干预组除了E-cad的蛋白表达水平降低以外,上述其余指标明显增高,特别是α-SMA的表达水平高于TGF-β1组。2.在Gal-3 KD和Gal-3 OE NRK-52E细胞各个亚组中,都呈现出和正常NRK-52E中相同的趋势,但Gal-3 OE NRK-52E细胞各亚组的总体趋势高于Gal-3 KD细胞各亚组。3.在正常NRK-52E细胞中,与对照组相比,模型组的LC3B-II/I的比值增加,P62蛋白的表达水平下降（P＜0.05）,自噬增强;在SF-MSCsCM干预24 h组里,与模型组相比,TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组的LC3BII/I的比值进一步上调,而P62蛋白表达水平进一步下降（P＜0.05）,说明自噬进一步增强;而与TGF-β1+SF-MSCs-CM干预组相比,TGF-β1+SFDMEM干预组的LC3B-II/I的比值降低,P62蛋白的表达水平增加（P＜0.05）,表明自噬减弱;与对照组对比,单纯SF-MSCs-CM干预组里LC3BII/I的比值增加,P62蛋白的表达水平减少（P＜0.05）,表明单纯SF-MSCsCM干预会增加正常NRK-52E细胞的自噬;而SF-MSCs-CM干预48 h后自噬相关指标下降。4.在Gal-3 KD和Gal-3 OE NRK-52E细胞各个亚组中,自噬相关指标都呈现出和正常NRK-52E中相同的趋势,但Gal-3 OE NRK-52E细胞各亚组的自噬相关指标低于Gal-3 KD细胞各亚组。结论:SF-MSCs-CM可能通过抑制Gal-3/PI3K/Akt/m TOR信号通路增强细胞自噬。同时,SF-MSCs-CM可能通过抑制Gal-3/PI3K/Akt/GSK3β/S nail信号通路来阻止EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮-间质转分化）,协同改善TGF-β1诱导的肾纤维化。靶向Gal-3可能是一个潜在的有价值的治疗肾纤维化靶点。
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