猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起猪的一种烈性传染病,具有急性、热性、高度接触性等特点,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。CSFV强毒株感染可导致典型CSF的发生,临床上以出血综合征与免疫抑制为主要特征。近年来由于中等毒力或弱毒CSFV的出现,导致猪群中发生持续的隐性带毒与免疫抑制等状况,这给CSF的控制与净化带来了更大的困难与挑战。当CSFV感染猪时,单核巨噬细胞和血管内皮细胞虽然是主要的亲嗜性细胞,但CSF发生中出现的免疫抑制主要是由于淋巴B细胞与T细胞的大量减少造成的。淋巴细胞的减少除了与体内的细胞因子紊乱有关外,凋亡的触发也起着重要作用。研究表明,CSFV可通过抑制宿主细胞干扰素的产生与细胞凋亡,实现对亲嗜性细胞的持续感染与病毒的大量复制。近年来,有关CSFV与宿主细胞相互博弈的研究虽然在不断深入,但有关CSF的发病机制与免疫功能紊乱机制仍不清楚。因此,开展CSF的致病机制,特别是CSFV免疫逃逸机制的研究,对CSF的防控具有十分重要的意义。自噬是细胞进化中非常保守的一种防御机制,在病毒感染过程中具有十分重要的作用。最新研究表明,多种病毒都可通过诱导线粒体自噬对细胞内损伤的线粒体进行清除。另有研究表明,自噬对细胞凋亡、细胞内代谢也具有重要的调控作用。我们的前期研究也表明,CSFV感染不但可以诱导细胞自噬的发生,而且可以利用自噬促进CSFV的复制与病毒粒子的释放。在此基础上,本论文一方面通过对CSFV与细胞线粒体自噬相互关系的研究,揭示线粒体自噬对CSFV复制以及细胞凋亡的影响。另一方面还通过对CSFV感染猪脾脏组织内自噬与凋亡相互关系的分析,揭示自噬在脾脏细胞死亡中发挥的作用。此外,本论文利用代谢组学技术对CSFV感染的PK-15与3D4/2细胞代谢物的多参数动态变化进行检测,分析了糖代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢与脂肪酸代谢在CSFV复制与天然免疫逃逸中的作用。CSFV诱导线粒体自噬抑制细胞凋亡的机制研究。病毒感染过程中可将其蛋白通过线粒体定位序列靶向锚定于细胞线粒体导致线粒体损伤,同时病毒可特异性的诱导细胞线粒体自噬清除损伤的线粒体并恢复线粒体稳态。为了揭示CSFV感染诱导细胞线粒体自噬以及线粒体自噬在CSFV感染中的作用机制,我们选取CSFV易感的PK-15细胞与猪固有免疫细胞-肺泡巨噬细胞3D4/2作为CSFV感染模型。首先利用westonblot对细胞感染csfv后不同时间线粒体的数量进行了分析。结果显示,细胞感染csfv后36h线粒体的数量开始减少。为了确认csfv感染诱导的细胞线粒体减少与自噬发生的相关性,我们分别应用自噬抑制剂3-methlyadenine(3-ma)与溶酶体递呈抑制剂bafilomycina1(bafa1)对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的自噬发生与溶酶体递呈过程进行阻断,然后利用westonblot检测细胞内线粒体数量的变化。结果表明,3-ma与bafa1均可阻止csfv感染细胞的线粒体数量减少,这提示csfv感染促进细胞内线粒体自噬的发生。为了进一步证实csfv感染诱导细胞线粒体自噬的发生,我们利用透射电镜技术对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体形态变化进行了观察。结果发现,csfv感染可导致细胞内出现大量膜状结构包裹的线粒体,表明csfv感染可诱导细胞线粒体自噬样结构的形成。为探讨csfv感染诱导细胞线粒体自噬发生的机制,我们又对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体进行了分离纯化,再通过westonblot技术对纯化线粒体的pink1与parkin蛋白分子富集程度进行了检测。结果表明,csfv感染促进了细胞pink1与parkin分子的线粒体移位。为了确定csfv感染增强细胞parkin分子的泛素化连接酶活性作用,我们利用免疫沉淀与westonbot对csfv感染pk-15与3d4/2细胞内parkin下游分子-mfn2蛋白的泛素化水平进行了检测。结果证明,csfv感染诱导的细胞内mfn2蛋白减少与parkin分子对mfn2蛋白的泛素降解是密切相关的。在证明了csfv感染诱导细胞pink1-parkin通路激活的基础上,为了进一步验证parkin分子的线粒体移位与线粒体自噬的直接联系,我们利用激光共聚焦技术对csfv感染的pk-15与3d4/2细胞的parkin、gfp-lc3、线粒体三者之间的共定位情况进行了分析。结果发现,csfv感染可导致细胞内parkin标记的线粒体与自噬体发生融合。为了进一步证明csfv感染诱导细胞线粒体完全自噬的发生,我们利用mito-mrfp-gfp线粒体自噬双荧光报告系统对csfv感染pk-15与3d4/2细胞线粒体的溶酶体递呈情况进行了分析。结果显示,csfv感染导致细胞内线粒体呈现更多rfp荧光,证明了csfv感染可引起溶酶体对线粒体的降解。另外,为了确认csfv感染pk-15与3d4/2细胞线粒体自噬体与溶酶体的融合,我们利用激光共聚焦技术对细胞内gfp-lc3、线粒体、溶酶体三者的共定位情况进行了观察。结果发现,csfv感染细胞内与gfp-lc3荧光斑点融合的线粒体同时可以与溶酶体发生融合,说明csfv感染诱导细胞线粒体自噬溶酶体的产生。在证明了csfv感染诱导pk-15与3d4/2细胞线粒体完全自噬发生的基础上,本论文进一步研究了csfv感染细胞内线粒体活动的变化。我们利用共聚焦显微镜对csfv感染pk-15与3d4/2细胞的线粒体形态以及drp1分子的线粒体移位情况进行观察,证明了csfv感染可导致细胞内线粒体分裂的产生。为了进一步研究线粒体分裂与线粒体自噬对csfv复制的影响,我们通过rna干扰技术下调pk-15和3d4/2细胞drp1和parkin基因的功能,应用westonblot、qpcr与间接免疫荧光技术对csfv的npro蛋白表达水平、病毒拷贝数与病毒滴度进行了测定。结果证明,下调细胞drp1与parkin基因功能可显著降低csfv的npro蛋白表达、病毒拷贝数与病毒滴度,表明csfv可利用感染诱导的细胞线粒体分裂与线粒体自噬促进病毒复制。为了阐明csfv感染诱导细胞线粒体分裂与线粒体自噬促进病毒复制的机制,我们对drp1与parkin基因功能下调的csfv感染pk-15和3d4/2细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和parp的表达水平进行检测,并应用流式细胞技术对细胞凋亡情况进行了分析。结果表明,抑制csfv感染细胞的线粒体分裂与线粒体自噬可促进细胞凋亡。csfv感染导致猪脾脏t区部分细胞自噬性死亡。脾脏作为机体重要的外周免疫器官,有多种类群的巨噬细胞与淋巴细胞,并且是csfv体内复制的重要场所。据此,本研究选取猪的脾脏作为靶器官对csfv体内感染过程中病毒、自噬与凋亡的相互关系进行研究。首先我们应用免疫组化技术对脾脏组织中csfv的e2蛋白染色检测csfv对脾脏细胞的感染情况。结果显示,csfv感染猪的脾脏内大部分细胞呈现阳性。为研究csf发生过程中脾脏组织自噬水平的变化,我们利用westonblot对脾脏组织细胞lc3-ii与sqstm1/p62的表达情况进行了检测。结果发现,csfv感染猪脾脏组织的lc3-i向lc3-ii的转化与sqstm1/p62的降解增强,提示csfv感染导致猪脾脏组织自噬水平增加。同时,我们还通过westonblot对脾脏组织自噬相关蛋白atg5与becn1的表达水平进行了检测。结果表明,csfv感染可促进脾脏组织atg5与becn1的表达,进一步验证了csfv感染引起脾脏组织自噬途径的活化。为了检测csfv感染诱导脾脏组织中自噬阳性细胞的分布情况,我们应用免疫组化方法对脾脏组织的lc3-ii分子阳性反应进行了检测。结果显示,csfv感染猪脾脏组织中的自噬阳性细胞主要集中于脾小体周围。在此基础上,我们又通过流氏细胞术对csfv感染猪脾脏组织中的细胞凋亡情况进行检测,发现csfv感染可显著促进脾脏组织的细胞凋亡。为了再次确认csfv感染与脾脏细胞凋亡的关系,我们对csfv感染猪脾脏组织的凋亡标志性蛋白进行了检测。结果显示,csfv感染引起猪脾脏组织活化形式的caspase-8、caspase-9、caspase-3和parp的表达增加,提示csfv感染导致猪脾脏组织凋亡信号活化。为了解csfv感染诱导的凋亡阳性细胞在脾脏组织的分布情况,我们应用tunel标记法对csfv感染猪脾脏内的凋亡阳性细胞进行了检测。结果显示,csfv感染可导致脾脏内凋亡阳性细胞同样分布在脾小体周围,提示csfv感染猪脾脏组织内凋亡与自噬之间的密切关系。为了进一步研究csfv感染猪脾脏组织内自噬与凋亡的相互关系,我们应用激光共聚焦技术对csfv感染猪脾脏组织细胞lc3-ii与tunel的共定位情况进行了分析。结果显示,csfv感染导致猪脾脏组织内部分lc3-ii阳性细胞(约40%)同时呈现tunel阳性,并且这些双阳性细胞主要分布在脾小体周围。以上结果提示,自噬在csf发生中可能导致脾脏组织细胞的死亡,并介导t区淋巴细胞的减少。为了阐明csfv感染脾脏组织内自噬、凋亡与病毒感染的关系,我们利用激光共聚焦技术对csfve2蛋白与lc3-ii分子、csfve2蛋白与tunel分子的共定位情况分别进行了分析。结果表明,csfv感染猪脾脏组织内大部分的自噬阳性细胞被csfv感染,与之不同的是凋亡细胞很少被csfv感染。值得注意的是,少部分未被csfv感染的细胞也呈现自噬阳性。csfv感染的代谢组学研究。病毒感染可引起细胞内某些代谢物质的变化并与疾病的发生有关,但有关csfv感染与细胞内的代谢物质变化关系的研究未见报道。本论文利用代谢组学技术对csfv感染的pk-15与3d4/2细胞代谢物质变化情况进行了检测分析。结果显示,在糖代谢方面,csfv感染导致pk-15细胞糖酵解途径中的葡萄糖、果糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸含量减少,也导致3d4/2细胞糖酵解途径中甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸含量减少,表明csfv感染导致细胞糖酵解途径中代谢物的利用率增加,提示csfv感染促进细胞糖酵解的发生。同时,csfv感染促进pk-15细胞三羧酸循环中柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸的产生,却抑制3d4/2细胞这3种物质的产生,提示csfv感染激活pk-15细胞三羧酸循环为病毒复制提供充足的能量,相反csfv感染可能通过抑制3d4/2细胞三羧酸循环限制细胞免疫功能发挥需要的能量。在核苷酸代谢方面,csfv感染pk-15细胞5-磷酸核酮糖含量减少,表明csfv感染导致PK-15细胞磷酸戊糖途径中代谢物的利用率增加,提示CSFV感染激活PK-15细胞磷酸戊糖途径并促进病毒RNA合成需要的戊糖产生。CSFV感染PK-15细胞葡萄糖醛酸、木糖醇、木酮糖、阿糖醇的含量均减少,表明CSFV感染导致PK-15细胞葡萄糖醛酸转化途径中代谢物的利用率增加,提示CSFV感染同样可激活PK-15细胞葡萄糖醛酸转化途径并促进戊糖产生。同时,CSFV感染PK-15细胞肌苷、肌苷酸、鸟嘌呤含量均减少,提示CSFV感染PK-15细胞病毒RNA合成活动对碱基的消耗增加。另外,CSFV感染3D4/2细胞5-单磷酸尿嘧啶的含量减少,也提示CSFV感染3D4/2细胞内病毒RNA合成活动对碱基的消耗增加。在氨基酸代谢方面,CSFV感染抑制PK-15细胞丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸降解途径、丙氨酸与天冬氨酸代谢途径、甘氨酸、丝氨酸与苏氨酸代谢途径、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸降解途径,提示CSFV感染抑制PK-15细胞的蛋白合成。与其相反的是CSFV感染激活3D4/2细胞缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸降解途径、丙氨酸、天冬氨酸与谷氨酸降解途径、β-丙氨酸代谢途径、牛磺酸与亚牛磺酸代谢途径,提示CSFV感染促进3D4/2细胞的蛋白合成。在脂肪酸代谢方面,CSFV感染PK-15细胞的棕榈烯酸、棕榈油酸含量减少,CSFV感染3D4/2细胞的棕榈油酸含量增加,提示CSFV感染可导致细胞脂代谢的紊乱,但这种影响因细胞种类而异。