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细菌的群体感应（quorum sensing,QS）是一种由自诱导物介导的细胞与细胞之间的交流机制,可以使细菌以细胞密度依赖的方式协调它们的行为。大多数自诱导物用于细菌的种内交流,而革兰氏阴性和革兰氏阳性菌均可产生的自诱导物-2（AI-2）能够介导细菌种间交流。但是,AI-2的两种已知受体（Lux P和Lsr B家族）并不存在于大多数能够对这种信号分子做出响应的细菌中,表明AI-2尚有未被发现的受体,这极大阻碍了人们对AI-2作为细菌群体行为协调的种间信号的认识。所以探寻新的未知AI-2受体及其介导的生理功能及调控机制具有重要意义。获得了如下研究成果:1、本研究发现条件性致病菌铜绿假单胞菌对AI-2信号表现出明显的正趋向性。通过对敲除预测趋化受体的铜绿假单胞菌PAO1突变体库的筛选,我们发现两个编码甲基化趋化受体蛋白的基因pct A和tlp Q介导AI-2对PAO1菌株的趋化性。PctA和Tlp Q均包含一个位于周质空间的d CACHE传感结构域。AI-2与PctA和Tlp Q的d CACHE结构域特异性结合并且诱导了PAO1的趋化性与并增强其生物膜形成能力。比较限硼和加硼两种条件下AI-2分子与PctA或Tlp Q的d CACHE结构域相互作用的亲和力差异,以及进一步分子对接模拟分析和蛋白定点突变实验表明PctA和Tlp Q的d CACHE结构域结合不含硼的AI-2活性构象R-THMF。以上研究表明PctA和Tlp Q为AI-2新型受体,AI-2通过这两个受体调控PAO1的趋化行为和生物膜形成。2、以PctA的d CACHE结构域序列检索PDB数据库,发现19个与其结构高度相似的细菌d CACHE结构域。其中结合枯草芽孢杆菌中组氨酸激酶Kin D和沼泽红假单胞菌中双鸟苷酸环化酶（DGC）rp HK1S-Z16的d CACHE结构域能响应AI-2。PctA、Tlp Q、Kin D和rp HK1S-Z16的胞外d CACHE结构域均属于d Cache＿1亚家族。通过对Pfam中含d Cache＿1结构域的跨膜信号转导蛋白进行序列多重比对分析,发现来自细菌和古菌的1535个d Cache＿1结构域含有对应于PctA配体结合口袋关键5个保守氨基酸残基。从中随机挑选蛋白表达后进行验证发现它们均能与AI-2特异性结合,暗示这1535个含5个保守位点的d Cache＿1结构域是AI-2信号的潜在受体。以上研究表明,含有d CACHE结构域且可以感知AI-2的信号的各种转导蛋白广泛分布于原核生物中。3、AI-2是肠道细菌产生的QS信号分子之一,但其在这些细菌中发挥的生理作用仍知之甚少。我们发现在鼠伤寒沙门氏菌SL1344中AI-2独立于其经典受体Lsr B在细菌运动-固着转换中发挥作用。虽然没有在SL1344基因组中找到编码d Cache＿1结构域的蛋白,但存在5个跨膜蛋白的传感结构域与d Cache＿1结构域的序列比对E值小于1E-3。通过弧菌发光实验及等温量热滴定分析,其中只有Yea J蛋白通过其周质的GAPES1结构域以高亲和力结合AI-2信号分子。Yea J具有双鸟苷酸环化酶（DGC）活性,体内外DGC酶活实验和相关表型实验表明,AI-2作为Yea J的激活剂,调节鼠伤寒沙门氏菌的细胞内c-di-GMP水平,从而介导了细菌的运动-固着转换过程。经由pfam数据库分析可知,预测具有N-端GAPES1结构域和C-端GGDEF结构域的Yea J同源蛋白广泛分布在肠杆菌目中。随机挑取来自不同属细菌的这些蛋白通过弧菌发光实验进行进行AI-2结合活性检测,发现它们均特异性结合AI-2。以上研究结果表明GAPES1结构域是一种识别AI-2信号的新型胞质外传感器,由AI-2调节DGC活性的Yea J同源蛋白在肠杆菌目中广泛存在。4、AI-2通过Yea J调控鼠伤寒沙门氏菌胞内c-di-GMP水平,而c-di-GMP对细菌毒力的调控具有重要作用。AI-2通过激活Yea J负向调节鼠伤寒沙门氏菌T3SS-1效应蛋白的合成和分泌,而细胞和动物实验的结果也表明AI-2通过调节Yea J的功能对鼠伤寒沙门氏菌毒力产生负调控作用。接下来,我们进一步研究表明了AI-2调控的c-di-GMP水平变化是发生在转录水平。其中T3SS-1的转录激活因子Inv F的伴侣蛋白Sic A特异性结合c-di-GMP,c-di-GMP与Sic A的结合抑制了Inv F/Sic A复合物的形成,导致复合物与其靶启动子的结合减少,从而降低了T3SS-1效应蛋白的表达和分泌。通过序列比对我们发现与Sic A具有一定同源性的Ces D/Syc D/Lcr H家族蛋白广泛分布于革兰氏阴性细菌尤其是变形菌门中。随机挑选来自于不同属病原菌的该家族蛋白分析验证发现它们都能以高亲和力结合c-di-GMP。因此在革兰氏阴性病原菌T3SS的Ces D/Syc D/Lcr H伴侣蛋白家族中,存在一系列的c-di-GMP效应蛋白,AI-2介导的细菌胞内c-di-GMP水平变化可以通过该家族调控细菌毒力。