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萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)个体小(约300μm),生活周期短(5-7天),易于培养,衰老表征明显,是潜在的进行衰老生物学研究的模式动物。白藜芦醇(Resveratrol)是植物在压力环境中合成的植物多酚,能够延长从单细胞酵母到高等哺乳类动物的寿命,是目前研究较多的外源性抗衰老物质。饮食限制(dietary restriction, DR)是在不导致营养不良的情况下适度的降低对能量的摄取,是实验室中最有效的延长寿命的手段之一。虽然有研究表明白藜芦醇是通过“类饮食限制”途径延长受试动物的寿命,但其抗衰老机制目前还不十分清楚。本文通过比较白藜芦醇和饮食限制对萼花臂尾轮虫寿命和生殖的影响,探究两者是否是通过同一个途径发挥抗衰老效应。本文还通过cDNA末端快速克隆(RACE, rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆出萼花臂尾轮虫的BcMnSOD, BcCuZnSOD, BcCAT, Bchsp40, Bchsp60, Bchsp70和Bchsp90基因全长。并研究了白藜芦醇和饮食限制对BcMnSOD, BcCuZnSOD, BcCAT, Bchsp40, Bchsp60, Bchsp70和Bchsp90表达的影响。探讨抗氧化酶基因和hsps基因在轮虫衰老中的作用。本论文的研究内容主要有以下5个方面：1、轮虫基因克隆及其结构、功能研究根据其他物种的MnSOD, CuZnSOD, CAT, hsp40, hsp60, hsp70和hsp90的基因序列,通过同源比对找到各自基因的保守区,设计兼并引物,PCR扩增片段经NCBI BLAST确认后,利用RACE技术扩增出全长,最终得到了萼花臂尾轮虫BcMnSOD, BcCuZnSOD, BcCAT, Bchsp40, Bchsp60, Bchsp70和Bchsp90基因序列。基因信息如下表所示：2、轮虫衰老表征研究从休眠卵孵出0-2h的萼花臂尾轮虫幼体长约180±13μm,12h后长至成体大小,约300±20μm。1龄(1d)轮虫通常携带1-2个无性卵,2-3龄(2-3d)轮虫通常携带2个以上的无性卵,从4龄(4d)开始生殖速度逐渐变慢,5龄(5d)轮虫大多数不再繁殖,出现明显衰老的迹象,体型变宽,有的个体的棘刺明显。萼花臂尾轮虫平均寿命为102±5.6h,平均绝对生殖量为15.5±1.2。随轮虫年龄增加,游动速度整体呈先上升后下降的趋势。刚从休眠卵孵出0-2h的幼体运动速度为0.78±0.02mm/s(约4.3倍体长/s),在第二天达到最大值1.89±0.05mm/s(约6.3倍体长/s),3龄,4龄,5龄轮虫的游动速度分别为1.80±0.05mm/s(约6倍体长/s),1.14±0.1mm/s(约3.8倍体长/s),0.84±0.06mm/s(约2.8倍体长/s)。3、轮虫衰老对基因表达的影响研究利用荧光定量PCR技术检测轮虫衰老过程中抗氧化酶基因和hsps基因的表达量的变化。结果显示随着轮虫的衰老,BcMnSOD mRNA的表达量降低；BcCuZnSOD mRNA的表达量呈先上升后下降的趋势,但是表达量始终高于刚孵出的轮虫(P<0.05),在4龄轮虫中表达量达到最大值；BcCAT mRNA的表达随轮虫衰老则没有明显的变化；Bchsp70mRNA的表达随轮虫年龄的增加而降低(P<0.05); Bchsp40mRNA的表达量仅在4龄轮虫中有显著性差异(P<0.05),在其他年龄段轮虫中表达量无显著性差异；Bchsp60mRNA的表达量在1,2和3龄轮虫中显著下降(P<0.05)；2龄,3龄和4龄轮虫中Bchsp90mRNA表达量显著低于孵出0-2h的轮虫(P<0.05)。4、白藜芦醇和饮食限制与轮虫寿命、生殖和抗氧化性研究结果表明：白藜芦醇对萼花臂尾轮虫的寿命没有显著地影响。低浓度的白藜芦醇(5μM)能够促进轮虫的繁殖,增加轮虫的绝对繁殖量,缩短第一幼体的孵出时间。而高浓度的白藜芦醇(50μM)会严重干扰轮虫的生殖。50μM的白藜芦醇虽不影响轮虫休眠卵的孵化,但是会影响无性卵的成熟。饮食限制(DR12,间隔12h投喂)能够显著地延长(P<0.01)萼花臂尾轮虫的寿命,同时会严重降低(P<0.01)轮虫的生殖量。白藜芦醇和饮食限制对萼花臂尾轮虫的寿命、生殖有着截然不同的影响,表明两者的抗衰老途径并完全不相同。此外,白藜芦醇的预处理也不能改善4龄轮虫的游动速度,而饮食限制(DR12,经过12h饥饿)预处理的轮虫在4龄时游动速度显著高于对照组。在氧化压力(百草枯,paraquat)环境下暴露12h时,DR12预处理的轮虫的存活率为0.784±0.02,显著高于(P<0.05)对照组0.60±0.25,在暴露24h时,饮食限制预处理的轮虫的存活率为0.55±0.02,同样显著高于(P<0.05)对照组0.38±0.02,表明饮食限制预处理能够增加轮虫对氧化压力耐受能力,而白藜芦醇的预处理则并不能提高轮虫在氧化环境中的存活率。5、白藜芦醇和饮食限制对基因表达的影响研究实时荧光定量PCR结果显示白藜芦醇虽能显著地增加BcMnSOD mRNA的表达,却会抑制BcCuZnSOD和BcCAT mRNA的表达。轮虫在饥饿24h时,BcMnSOD mRNA的表达增加,而在饥饿48h时,BcMnSOD mRNA表达量下降；饥饿12h,24h和48h能够显著地增加BcCuZnSOD和BcCAT mRNA的表达。表明BcCuZnSOD和BcCAT高表达对延缓轮虫的衰老起着重要的作用。饮食限制还能提高轮虫Bchsp40, Bchsp60, Bchsp70和Bchsp90mRNA的表达,表明hsps基因的高表达也是延长轮虫寿命所必需的。6、维生素E和过氧化氢(H2O2)对基因表达的影响研究维生素E作为外源抗氧化剂,能够短暂的增加BcMnSOD, BcCuZnSOD和BcCAT mRNA的表达,在维生素E处理2h时,这三个抗氧化基因的表达量均达到最大值(P<0.05),随后表达量开始降低,在处理6h时检测,这三个基因mRNA的表达量和对照组没有显著性差异。维生素E的处理同样能短暂的提高Bchsp70和Bchsp90mRNA的表达,在维生素E中暴露超过6h, Bchsp70和Bchsp90的表达量显著低于对照组(P<0.05)；此外,维生素E会显著地降低(P<0.05) Bchsp40的表达和提高(P<0.05) Bchsp60mRNA的表达。过氧化氢H202作为外源氧化剂,能够显著影响轮虫衰老相关的基因的表达。0.1mM的H2O2能够增加BcMnSOD, BcCuZnSOD和BcCAT mRNA的表达,而0.2mM的H2O2只能短暂的提高BcMnSOD, BcCuZnSOD和BcCAT mRNA的表达,处理时间超过6h时,3cMnSOD, BcCuZnSOD和BcCAT的表达恢复正常水平。0.1Mm和0.2Mm的过H2O2均能显著地提高轮虫Bchsp40, Bchsp60, Bchsp70和Bchsp90mRNA的表达,并能维持在相对高的表达水平。