苹果光敏色素互作因子基因MdPIF1的克隆和功能鉴定

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苹果(Malus domestica B.)是世界上栽培最广泛的果树之一,光是影响苹果生长发育以及产量和品质形成的最重要的环境因子之一。它不仅提供光合作用所需要的能量,还提供苹果用于适应周围环境进行正常生长发育所需要的信息。本研究从嘎啦苹果(Malus×domestic cv.‘Royal Gala’)中克隆了光响应基因MdPIF1,并通过农杆菌介导的方法将该基因转入苹果愈伤以及拟南芥,对其功能进行了鉴定,主要研究结果如下。1. MdPIF1基因的克隆以拟南芥的PIF1/PIL5基因(GenBank accession number NC001145.3)cDNA序列为信息探针,BLAST搜索GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)的苹果EST数据库,对EST序列进行反复比对和拼接,获得一条苹果的同源片段。通过电子克隆和RACE技术获得该片段的cDNA全长,将其命名为MdPIF1(MDC011443.241)。2. MdPIF1序列分析MdPIF1编码区长1894bp,序列分析表明MdPIF1具有8个内含子;利用MEGA4.0对bHLH蛋白进行进化树分析,将MdPIF1和所有的拟南芥bHLH蛋白进行聚类,发现MdPIF1蛋白与AtbHLH015(AtPIF1)紧密聚在一起。基因组比较分析表明,它们的基因组结构相似,都含有9个外显子。3. MdPIF1的组织表达分析和逆境响应分析通过半定量PCR对MdPIF1在各组织中的转录水平进行分析。结果表明:MdPIF1呈组成型表达,在苹果的春梢、休眠芽、花苞、花、幼叶、成熟叶片、幼果、果皮以及愈伤组织中均检测到该基因的表达。另外作为一个bHLH转录因子,我们利用半定量PCR检测苹果实生苗中MdPIF1基因在非生物胁迫条件下的表达情况,结果表明MdPIF1基本不受低温、盐、ABA、PEG的影响。4. MdPIF1在层积种子和打破休眠芽中的表达分析通过半定量PCR对MdPIF1在苹果层积种子和处于打破休眠阶段的芽的转录水平分析。结果表明,在层积种子中,随着种子休眠的打破,MdPIF1的表达量逐渐降低。相反的,随着芽休眠的打破,MdPIF1的表达量逐渐升高。5.在拟南芥pif5-1功能缺失型突变体和苹果愈伤中过量表达MdPIF1为了检测MdPIF1基因在植物中的功能,我们构建了过表达载体,用35S启动子驱动MdPIF1基因,并转化拟南芥以及苹果愈伤,在转基因拟南芥株系和苹果愈伤细胞系中,MdPIF1的均过量表达,转基因系的光敏色素介导的光响应和生长发育受到抑制,表明MdPIF1该基因参与了光敏色素介导的光响应信号转导。
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