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寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)是一种能够特异性积累二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA)的异养海洋微藻,其细胞内DHA含量占总油脂含量的30-50%,而其他多不饱和脂肪酸含量不足1%。由于寇氏隐甲藻在DHA的生产上有着天然的优势,近些年来寇氏隐甲藻已经被工业上广泛的应用。因此,提高寇氏隐甲藻油脂和DHA的产率具有重要意义。然而,由于寇氏隐甲藻的基因组非常大,到目前为止其基因组的测序工作仍然没有完成,这限制了对寇氏隐甲藻中油脂和DHA积累分子机制的探索。再者,寇氏隐甲藻中缺乏有效的遗传转化体系,这也进一步限制了通过合成生物学或代谢工程的研究手段提高藻种性状的可行性。本研究在寇氏隐甲藻中建立了基于化学诱导剂的实验室适应性进化新策略,提高了寇氏隐甲藻胞内油脂和DHA的产率。此外,本研究也在寇氏隐甲藻中建立了稳定的遗传转化体系为未来探索其油脂性状的分子机制以及有效的遗传改造奠定了基础。化学诱导剂能够通过抑制特定蛋白酶影响细胞内特定代谢途径。本研究首先通过开发一种基于化学诱导剂的实验室适应性进化的方法,简称为CM-ALE,对隐甲藻进行两轮进化改造。第一轮进化,选择乙酰辅酶A羧化酶特异性抑制剂烯禾啶作为选择压力。研究结果表明,进化获得的突变体E-S可以将胞内淀粉代谢中的碳源引入油脂代谢,进而提高油脂的含量。芝麻酚作为一种抗氧化剂可以促进寇氏隐甲藻细胞生物量的积累,但是芝麻酚的添加会抑制寇氏隐甲藻细胞内油脂的合成。为了解除这一“trade-off”效应,本研究选择芝麻酚提供第二轮选择压力,以E-S为出发菌株进行进化实验。结果表明在突变株E-D培养过程中添加1 mM的芝麻酚,可以有效淬灭胞内ROS,提高其生物量(30%)。最终将油脂和DHA的产率分别提高了 100%和130%。本研究中,采用FITC-Dextran荧光分子为标记,建立并优化了寇氏隐甲藻的电击转化体系。结果发现,在2.0kV,200Q,50 μF的条件下可以高效的将外源的大分子物质导入寇氏隐甲藻细胞内。进一步以RuBisCO作为目标蛋白进行改造,研究发现,敲减RuBisCO蛋白可以优化细胞内能量和碳源物质的分配,促进细胞的生长和油脂的积累。