血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)衰老是动脉粥样硬化和高血压等心血管疾病发生发展的诱因之一。衰老的VSMC通过分泌致炎因子和血管重构相关因子促进血管重构和血管老化,其中,成骨样转化是伴随细胞衰老而出现的一种表型重构形式,后者是诱发血管硬化、组织器官退行性变和功能失调的重要因素。衰老的细胞具有生长停滞、细胞骨架僵硬、炎性因子分泌增多等特征性表现。平滑肌(smooth muscle,SM)22α蛋白是一种平滑肌特异性标志物,主要分布于成熟平滑肌细胞,其基本功能是调节细胞骨架形成。近年研究显示,在衰老细胞中SM22α表达升高,SM22α的同源蛋白Scp1p敲除后可延长酵母细胞寿命。然而,SM22α与细胞衰老的因果关系和分子机制尚不清楚。目的:本研究以血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)为诱导因素,通过建立VSMC衰老模型,试图从体内外证实SM22α在VSMC衰老和血管老化进程中的作用,并探讨其作用机制,以期为揭示衰老相关心血管疾病的发生机制提供研究证据。方法:利用Ang II(10-7 mol/L)慢性刺激VSMC(5天),获得VSMC应激衰老模型;利用连续传代的方法建立VSMC复制衰老模型。用野生型和Sm22α基因敲除小鼠皮下植泵,持续灌注Ang II(1μg/kg/min)四周,复制高血压模型。通过敲低和过表达SM22α以观察其对VSMC衰老及相关调控通路蛋白表达和活性的影响。衰老相关标志物SA-β-gal染色分析、Real-time PCR、Western blot、免疫荧光和免疫组化检测用于鉴定VSMC衰老;免疫共沉淀检测蛋白质相互作用。使用钙化培养基(含有2.5 mmol/L磷酸盐的低糖DMEM培养基)处理细胞,诱导VSMC钙化;用茜素红染色、钙离子含量测定以及钙化标志物检测进行表型鉴定。结果:1 SM22α促进Ang II诱导的VSMC衰老1.1 Ang II诱导VSMC衰老过程中SM22α表达上调为了确定SM22α在VSMC衰老过程中的作用,利用Ang II诱导建立VSMC衰老模型。Ang II持续刺激VSMC 5天和7天后,SA-β-gal活性显著增强,衰老标志蛋白p53、p21和γ-H2AX表达增高,核增殖抗原PCNA表达下调,表明细胞进入生长停滞的衰老状态;Western blot结果显示,在此过程中,SM22α的表达显著上调,与细胞衰老进程具有平行关系。1.2 SM22α促进Ang II诱导的VSMC衰老为确定SM22α在VSMC衰老过程中表达增高的意义,分别利用小干扰RNA敲低和腺病毒载体过表达SM22α,观察其对VSMC衰老的影响。结果显示,敲低SM22α表达可降低衰老标志物的表达水平和活性,SA-β-gal活性增高以及p53和p21表达明显低于对照组;而过表达SM22α则可促进Ang II诱导的SA-β-gal活性增高以及p53和p21表达增加。结果表明,SM22α对Ang II诱导的VSMC衰老具有促进作用。1.3缺失SM22α可改善Ang II诱导的高血压和血管老化为验证SM22α是否在体内也具有促进VSMC衰老的作用,通过皮下植入Ang II微渗透泵复制高血压模型,观察模型小鼠血压变化以及与血管老化的关系。结果显示,Sm22α-/-小鼠血压升高幅度较野生型小鼠明显降低,并且其主动脉组织中p53和p21蛋白表达水平和SA-β-gal活性也低于野生型小鼠。进一步提示SM22α表达增加与VSMC衰老具有因果关系。2 SM22α促进VSMC衰老的机制2.1 SM22α抑制p53泛素化前已证实,VSMC衰老过程中,SM22α与p53表达变化具有相同趋势。为确定二者之间是否具有内在因果关系,通过敲低和过表达SM22α,观察对p53表达的影响。结果表明,在Ang II诱导VSMC衰老过程中,无论是敲低还是过表达SM22α,对p53的m RNA水平都没有明显影响;但是,敲低SM22α可提高p53泛素化水平,而过表达SM22α则降低p53泛素化。提示SM22α可影响p53的泛素化修饰。2.2 SM22α抑制Mdm-2与p53的相互作用泛素化蛋白酶体途径是p53降解的主要机制。为进一步揭示SM22α调节p53泛素化的分子机制,利用免疫共沉淀的方法检测p53与其泛素连接酶Mdm-2结合是否受SM22α表达的影响。结果表明,在Ang II诱导VSMC衰老条件下,SM22α表达下调可促进Mdm-2与p53的结合,上调SM22α表达则抑制Mdm-2与p53的结合;用Mdm-2抑制剂nutlin-3预孵育VSMC可逆转SM22α表达下调导致的Mdm-2与p53相互作用,伴随p53泛素化水平降低和表达升高。上述结果表明,SM22α通过抑制Mdm-2与p53的相互作用进而抑制p53的泛素化降解。2.3 SM22α抑制Akt-Mdm-2通路活化为探究SM22α影响p53泛素化降解的上游信号通路,检测SM22α表达改变对Akt-Mdm-2信号通路活化的影响。结果显示,在Ang II诱导VSMC衰老条件下,敲低SM22α表达可促进Akt-Mdm-2激活,相反,过表达SM22α则抑制Akt-Mdm-2通路的激活;用PI3K/Akt抑制剂LY294002预孵育VSMC可消除敲低SM22α引发的Akt-Mdm-2激活效应。同样,在Sm22α基因敲除小鼠动脉组织中Akt和Mdm-2的磷酸化水平也显著高于野生型小鼠。结果表明,SM22α对p53泛素化降解的调节是通过Akt-Mdm-2信号通路介导的,过量的SM22α具有稳定p53的作用。3 VSMC衰老诱发血管钙化的初步研究3.1 VSMC复制性衰老促进细胞钙化为确定VSMC衰老与血管钙化的关系,首先利用连续传代的方法建立细胞复制性衰老模型,再换用高磷酸盐钙化培养基诱导钙化。SA-β-gal衰老染色和衰老标志物检测表明,13代(P13)的VSMC表现出明显的衰老特征。茜素红染色和钙离子含量测定结果显示,与对照组相比,P13的VSMC钙离子沉积明显;钙化相关调控因子BMP-2,OPN和ALP的表达活性升高,表明衰老的VSMC发生成骨样转化。3.2 VSMC应激性衰老与细胞钙化的关系为确定VSMC应激诱导衰老与钙化的关系,利用Ang II诱导VSMC应激衰老,并诱导钙化。细胞钙化检测结果显示,发生应激性衰老的VSMC其钙离子沉积明显增多,钙化相关调控因子BMP-2,OPN和ALP的活性也明显高于未衰老的细胞。结果表明,应激性衰老同样可促进细胞钙化发生。3.3敲低SM22α表达可抑制衰老相关钙化基于前两部分的研究发现,敲低SM22α可抑制细胞衰老,进而分析其与细胞钙化的关系。结果显示,si SM22α和Sm22α-/-组VSMC钙离子沉积减少,钙化调控因子BMP-2表达下调和ALP的活性下降,与减弱的衰老表型相一致,间接证明VSMC衰老与细胞钙化的因果关系。结论:1细胞衰老过程中SM22α表达增加。2过量的SM22α促进VSMC衰老和血管老化。3 SM22α蓄积抑制衰老相关信号通路Akt-Mdm-2的活化,减少p53泛素化降解,提高p53稳定性。4细胞衰老可促进VSMC成骨样转化。