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目的:支气管肺发育不良(Bronchopulmonarydysplasia,BPD)是早产儿最严重的并发症之一,对呼吸、神经等系统的不利影响可持续至成年,至今其病因及发病机制仍未完全明确,肠道菌群变化被认为在肺部慢性疾病中起着重要作用。本研究旨在通过高通量测序技术对早产儿粪便样本16SrDNA基因进行测序,探讨肠道菌群对早产儿BPD发生、发展的影响,为BPD的预防及治疗提供可靠依据。方法:将2018年04月20日至2019年09月20 日期间于生后24小时内收住苏州大学附属儿童医院新生儿重症监护室(Neonatal intensive care unit,NICU)和/或苏州市立医院本部母子中心NICU、胎龄≤32周且住院时间≥28天的早产儿作为研究对象,采用前瞻性巢式病例对照研究(Nested Case-Controlstudy,NCCS)的方法,采集所有早产儿基本临床资料,分别于生后第1、4、7、14、21、28天留取粪便样本,将研究对象分为BPD组和非BPD组:根据BPD诊断标准将发展为BPD的早产儿作为BPD组,在未发生BPD的早产儿中按1:1的比例随机抽取一般资料与BPD组匹配的早产儿作为非BPD组,根据美国国立儿童卫生与人类发展研究院(National Institute of Child Healthand Human Development,NICHD)及其他疾病委员会于2000 年共同举办的BPD研讨会提出的分度标准将BPD组分为轻度和中/重度两亚组,分析BPD组与非BPD组及不同程度BPD亚组间的临床资料及基于16SrDNA高通量测序方法所得的肠道菌群情况。结果:一、临床基本资料信息:共151例早产儿纳入队列,其中58例发生BPD,纳入BPD组,其中轻度26例,中/重度32例,未发生BPD的93例中按1:1的比例与BPD组随机匹配为非BPD组,两组共116例。BPD组与非BPD组临床资料比较显示:(1)两组性别分布、出生体重、胎龄、分娩方式、是否为试管婴儿、是否双胎或多胎、Apgar 1分钟及5分钟评分、母亲一般情况、新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)、肺动脉高压、脑室周围-脑室内出血(periventricular intraventricular hemorrhage,PVH-IVH)、脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia,PVL)、新生儿肺炎、呼吸衰竭、贫血、败血症、坏死性小肠结肠炎(necrotizingenterocolitis,NEC)、开奶日龄、PICC置管、首次抗生素为非限制级、首次抗生素为限制级、首次抗生素为非限制级与限制级二联使用、使用二联及以上特殊级抗生素比较无显著差异(P>0.05)。(2)BPD组早产儿动脉导管未闭(patent ductus arteriosus,PDA)、频发呼吸暂停、早产儿视网膜病(retinopathy ofprematurity,ROP)、肠外营养相关性胆汁淤积症(parenteral nutrition associated cholestasis,PNAC)、宫外生长受限(extrauterinegrowthrestriction,EUGR)的发生率明显高于非BPD组,输血≥3次、有创通气、无创通气、单联特殊级抗生素使用率明显高于非BPD组,PICC置管时长、有创通气天数、无创通气天数、总吸氧天数、抗生素使用时长、肠外营养天数、住院时长均明显多于非BPD组,两组间比较有统计学差异(P<0.05)。Logistic多因素回归分析显示:频发呼吸暂停(OR=0.134,95%CI:0.030～0.603)、输血≥3次(OR=0.081,95%CI:0.015～0.429)及无创通气天数(OR=1.251,95%CI:1.111～1.409)为 BPD 发生的独立高危因素。二、粪便16SrDNA高通量测序结果:(1)物种相对丰度分析显示,在门分类水平上,变形菌门在BPD组和非BPD组中均有一过性增高,BPD组变形菌门相对丰度在生后第14天达高峰,非BPD组提前至生后第7天;且BPD组变形菌门相对丰度自生后第4天至28天始终低于非BPD组。(2)Alpha多样性分析结果:①BPD组与非BPD组间Alpha多样性分析结果:BPD组chao1指数、observed species指数在第7天时一过性增高,后逐渐降低,非BPD组chao1指数、observed species指数在第7天时一过性降低,自14天起逐渐稳定在某一水平。BPD组chao1指数、observed species指数在生后第4～28天始终高于非BPD组,且在生后第4、7天时,与非BPD组相比,BPD 组 chao1 指数、observed species 指数显著增高(P<0.05)。BPD 组 shannon指数、simpson指数随日龄的增加而减小,非BPD组shannon指数、simpson指数在第7天时一过性下降,后逐渐增大。BPD组shannon指数、simpson指数在4～14天时较非BPD组大,自21天起,两组指数基本相等,且在第4、7天时,BPD组shannon指数、simpson指数显著高于非BPD组(P<0.05)。②BPD不同亚组间Alpha多样性分析结果:轻度BPD亚组chao1、observed species指数自第4天起逐渐减小,在第21天时最小,后渐增大;中/重度BPD亚组chao1、observed species指数在第7天时一过性升高,第14天起降低。轻度BPD亚组chao1、observed species指数始终高于中/重度BPD亚组,且在生后第4天两组间差异显著(P<0.05)。轻度BPD亚组shannon、simpson指数在生后21天降至最低,后升高,中/重度BPD组shannon、simpson指数在第14天一过性下降,后逐渐增大。在生后第4天,轻度BPD亚组shannon指数显著高于中/重度BPD亚组(P<0.05),而两亚组间simpson指数在各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Beta多样性分析结果:自生后4天、7天,BPD组与非BPD组之间菌群差异突出,同组样本聚集在一起。(4)菌群群落结构差异显著性分析结果:①与非BPD组比较,BPD组从生后第4天开始已有差异菌群。在生后第4天起,BPD组变形菌门(P=0.028)显著减少,厚壁菌门(P=0.008)、拟杆菌门(P=0.003)、放线菌门(P=0.002)、红蝽菌纲(P=0.000)显著增多;在生后第7天开始,BPD组拟杆菌属(P=0.000)显著增多,克雷伯菌属(P=0.006)、肠杆菌属(P=0.004)显著减少;在生后第14天,BPD组肠杆菌属(P=0.003)、克雷伯菌属(P=0.016)、乳杆菌属(P=0.016)显著减少,葡萄球菌属(P=0.018)显著增多;生后第21天,肠杆菌属(P=0.008)显著减少,棒杆菌属(P=0.000)、普雷氏菌属(P=0.000)显著增多;生后第28天,BPD组肠杆菌(P=0.003)、链球菌(P=0.042)明显减少,棒杆菌(P=0.004)明显增多,差异有统计学意义。②轻度BPD与中/重度BPD两亚组比较:与轻度BPD亚组相比,中/重度BPD亚组链球菌(P=0.043)、双歧杆菌(P=0.022)显著减少。结论:(1)频发呼吸暂停、输血≥3次及无创通气天数是早产儿生后发生BPD的主要高危因素。(2)BPD组和非BPD组早产儿肠道菌群定植模式均表现为变形菌门的一过性增高,其相对丰度自生后第4天至28天BPD组均低于非BPD组,且BPD组变形菌门丰度达峰时间(生后第14天)晚于非BPD组(生后第7天)。(3)与非BPD相比,BPD早产儿生后第4天起肠道菌群多样性即明显增多,在第4、7天时增多显著;与轻度BPD相比,中/重度BPD的早产儿在生后第4天肠道菌群多样性显著减少。(4)发展为BPD的早产儿从生后第4天开始即有差异菌群,BPD组早产儿肠杆菌属、乳杆菌属减少,拟杆菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属增多。(5)不同程度BPD早产儿间存在差异菌群,双歧杆菌、链球菌减少与中/重度BPD的发生相关。