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中期因子(Midkine, MK)是一种肝素结合的细胞因子或生长因子,它的基因主要在胚胎期表达,随着发育的进展其表达组织逐渐局限,表达量逐渐减少：成年期个体仅在肺、结肠、胃、肾和脾等器官中极低地表达。近年来的研究发现,MK高表达于多种肿瘤组织。我们实验室先前的研究已表明,MK在癌组织中高表达(表达率为94.6%),且与癌旁组织和正常组织的表达有显著差异；进一步发现,MK的表达与肿瘤的临床分期及远处转移相关,而与肿瘤的组织分化、大小及淋巴结转移情况无关；免疫组化定位分析发现,MK蛋白广泛存在于肿瘤细胞的细胞质,且明显表达细胞外组织的腺泡处。这些结果提示MK有望成为新型的肿瘤标志物。可是,MK的检测体系还不完善；MK是否参与肿瘤的免疫逃逸尚不清楚；MK靶向治疗肿瘤的新方法需要探索。因此,本论文在以下方面进行了研究：1、人中期因子(Midkine)单克隆抗体和ELISA检测试剂盒的研制：为探讨MK作为肿瘤标志的可能性,本研究用MK重组蛋白免疫Balb/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选得到3株抗人MK单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中1C5杂交瘤细胞株较好。进一步利用1C5杂交瘤细胞株的腹水纯化获得单抗,HRP标记后,运用交叉配对法建立了ELISA检测体系,并通过比较24例肿瘤患者血清与正常人血清中的MK浓度进行了检测,初步评价了该检测体系。另外,运用筛选得到的抗MK单克隆抗体进行免疫印记试验,证实在胃癌组织和癌旁组织中MK的蛋白含量高于正常的胃粘膜组织。2、MK参与肿瘤免疫逃逸机制的探讨：目前的研究认为,MK主要具有诱发瘤细胞发生、促纤溶和细胞趋化、促进肿瘤血管形成及增强肿瘤细胞耐药性等方面的作用。可是,在肿瘤微环境组织中也有许多免疫细胞浸润,MK是否参与肿瘤的免疫逃逸尚不清楚。因此,为了探索MK在肿瘤免疫逃逸中的作用,利用基因芯片技术对MK高表达肿瘤细胞株BGC-MK进行相关基因分析,结果表明,当MK高表达时,肿瘤杀伤细胞(主要为NK细胞和CD8+T细胞)的活化配体MIC A/B也高表达,并经过RT-PCR、Q-PCR、FCM和ELISA确证,BGC-MK细胞的细胞膜表面和可溶性的MIC A/B表达都增加。进一步经过免疫共沉淀和染色体免疫共沉淀等试验发现,MK通过P38信号通路提高转录因子CHOP的表达,CHOP能与AP-1结合加强MIC A/B的表达。这些结果首次揭示了MK参与肿瘤免疫逃逸的新机制。3、MK靶向治疗肿瘤的新方法的探索：基于在胃癌组织和癌旁组织中MK的蛋白含量高于正常的胃粘膜组织的发现,我们认为MK可作为肿瘤靶向治疗的生物靶标。通常认为,与单克隆抗体相比,单链抗体(SCFV)可将药物、毒素、放射性核素等导向肿瘤,具很大的临床应用潜能等特性。为此,我们设计通用引物,采用RT-PCR方法从1C5杂交瘤细胞株中扩增抗体轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH,用重叠PCR把VH和VL用短肽(Ser4Gly)4连接起来,在c端引入6×His标签,与pMD18 T-vector连接测序正确后,将该片段克隆入大肠杆菌表达载体pET30a(+)中,转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选得到可诱导表达MK的SCFV重组蛋白工程菌株,经IPTG诱导及镍亲和柱纯化获得SCFV重组蛋白。进一步通过氧化葡聚糖的醛基与SCFV和阿霉素(DOX)的NH3反应,把SCFV和DOX连接起来形成靶向药物SCFV-DOX。体内外试验证明,SCFV-DOX能在MK高表达的肿瘤组织中有效富集,提高DOX抑制肿瘤生长的效应。这种MK靶向治疗肿瘤的新方法可望用于临床治疗。总之,本研究制备了人中期因子(Midkine)单克隆抗体,建立了MK的ELISA检测体系；首次揭示了MK通过调节MICA/B表达参与胃肿瘤免疫逃逸的新机制；利用MK单链抗体(SCFV)导向抗肿瘤药物的特性,探索了MK靶向治疗肿瘤的新方法。本研究为阐明MK在肿瘤发生用于发展中的作用机制及有效利用MK作为肿瘤靶向治疗的生物靶标都具有重要的意义。