Wiskott-Aldrich 综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)是一种 X 连锁的隐性遗传的免疫紊乱综合征。WAS由特异表达于造血系统的WAS基因突变所致,其产物WAS蛋白(WASP)是一种肌动蛋白成核促进因子,WASP缺陷会导致造血细胞和免疫细胞异常。目前,WAS的致病机理还不清楚,造血干细胞移植是治疗典型WAS唯一有效的手段,且受限于HLA配型,并易发生移植并发症。迄今为止,用于WAS疾病研究的哺乳动物只有小鼠。然而WASP缺陷小鼠没能完全模拟出WAS患者临床上的典型症状,如血小板减少程度较轻,没有出血迹象,也没有严重感染,而且这些WASP缺陷小鼠拥有正常的生长能力和生存能力。因而,培育一种更合适的WAS动物模型,将有利于更深入地研究WAS发病机理和开发WAS诊断方法与治疗方案,家兔是一种经典的实验动物。相比于小鼠,兔子的遗传背景和生理结构与人类更相似。因此,我们拟通过基因编辑方法建立一个WAS疾病兔模型,以更精确地模拟人类WAS疾病特征。在本研究中,我们设计了一对分别靶向兔WAS基因外显子2和7的sgRNAs,将这两条sgRNAs和Cas9 mRNA共注射到兔原核期受精卵胞质中,通过胚胎移植,获得10只仔兔,其中有9只为WAS基因编辑兔,效率高达90%。经过进一步交配繁殖获得了第一代仔兔和第二代仔兔共33只,其中包括插入缺失突变或大片段删除杂合子17只及纯合子8只。免疫印迹实验显示WAS敲除杂合子的WASP表达量减半,而纯合子(基因型为WAS/-或WAS-1,记为WASKO兔,)则没有检测到WASP。检测兔的血小板数量发现,与人类WAS患者相似,WASKO兔的血小板显著减少,部分兔的皮肤出现湿疹样出血性红斑。分析兔的淋巴细胞数量发现,WAS KO兔外周血和脾脏淋巴细胞显著减少;进一步分析显示外周血和脾脏T细胞减少,且外周血CD8+T细胞严重减少。这些免疫细胞的减少导致WASKO兔抵抗微生物病原体的能力下降,WAS KO兔在出生后10个月内相继因严重感染而死亡。通过对死亡兔的病理检测发现,WASKO兔的皮肤、肺、胃和肾中观察到了明显的充血或出血,以及炎症病灶,进一步说明WAS KO兔血小板减少和免疫系统的缺陷导致了其易于出血和易感染的病理特征。体重和生存期测试发现WASKO兔的生长发育在早期与正常兔差异不大,但1月龄后体重增速开始低于正常兔;其平均寿命为2个月,最长存活期为9个月。本研究利用CRISPR/Cas9成功建立了首个WAS疾病模型兔,精确地模拟了 WAS患者多种典型症状,包括血小板严重减少,出血倾向,淋巴细胞减少,严重的感染和降低的生存期。WAS疾病兔模型的成功建立将使兔替代小鼠,成为更优秀的WAS机理研究模型,为人类WAS疾病临床前研究提供一个重要研究工具。