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光合作用产生的纤维素资源是目前世界上发现的数量最大的可再生型资源,通过适当的方法将纤维素分子降解为C6H12O6,进而转化为人类所需要的各种产品,包括食物、能源和化工原料等等,这对于缓解当今世界的食物缺乏和能源短缺等方面都是不可小觑的。纤维素分子可以被微生物产生的纤维素酶(cellulase)所酶解,这是纤维素分子被利用的有效途径。纤维素酶由内切葡聚糖苷酶(EG)、外切葡聚糖苷酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)三种组分构成。各组分协同作用,可以将木质纤维素水解为葡萄糖。其中EG优先作用于无定形纤维素,切割β-1,4主键,进而由CBH和BG完成对纤维素分子的彻底降解。近些年来,国内外已经有大量的研究者对纤维素酶进行研究,基因的克隆和表达已经成为最主要的研究手段之一。本文在从黄山生态林腐木筛选出的具有较高纤维素酶活的匍枝根霉亚种点头根霉的基础上,构建内切葡聚糖苷酶基因工程菌,以期提高内切葡聚糖苷酶的酶活。主要研究成果如下：构建了匍枝根霉的cDNA表达文库,采用CMC-Na筛选培养基从cDNA文库中筛选重组子,成功的从文库中分离出产内切葡聚糖苷酶的重组菌株。对产内切葡聚糖苷酶的阳性克隆测序,经在NCBI上比对分析,eg2与米根霉RCE3的内切葡聚糖苷酶基因序列的相似性为65%,eg3与米根霉RCE1的内切葡聚糖苷酶基因序列的相似性为67%,所以此两个序列为编码内切葡聚糖苷酶的新序列。重组蛋白的分子量分别为44kDa、46kDa。阳性克隆在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基中发酵36小时内切葡聚糖酶活达到最大值,分别为1.174IU/ml和1.034IU/ml,相比出发菌株发酵时间缩短了54h。通过单因素和响应面法对装液量、初始pH、接种量、转速、酵母粉添加量等发酵条件进行优化,得到最优发酵条件为：装液量55mL/250mL.初始pH7.2、接种量10%、转速170r/min、酵母粉添加量0.4%。在此发酵条件下测得内切葡聚糖苷酶酶活为1.573IU/mL,比未优化条件下提高了33.9%。根据从匍枝根霉cDNA文库中分离出具有能够表达较高内切葡聚糖苷酶酶活的eg2基因设计了引物P1:5’-GAATTCAAACGACGGCCAGTGAAT-3’(其中划线部分为EcoR I酶切位点)P2:5’-GAATTCACCATGATTACGCCAAGC-3(其中划线部分为EcoR I酶切位点),用重组质粒pMA5-eg2作为模板PCR扩增出eg2基因,用具有强启动子p43的质粒pHY-p43将eg2基因成功枯草芽孢杆菌中进行表达,阳性克隆在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基中发酵36小时内切葡聚糖酶活达到最大值,酶活达到2.013IU/mL。