【摘 要】
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蓝舌病（Bluetongue,BT）是一种由呼肠孤病毒科、环状病毒属的蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）经库蠓等节肢昆虫叮咬反刍动物导致的传染病。全世界现已发现BTV有27种血清型,各血清型之间没有交叉保护作用,且病畜感染血清型不同或个体差异不同所表现的临床症状不同,给蓝舌病的防控和多价疫苗的研究带来了挑战。研发有效的蓝舌病检测诊断试剂盒对蓝舌病的防控意义重大。BTV的VP7蛋白
【基金项目】
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“十三五”国家重点研发计划项目——烈性外来动物疫病综合防控技术国际科技合作与联合研发（2017YFD0502306）；
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蓝舌病（Bluetongue,BT）是一种由呼肠孤病毒科、环状病毒属的蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）经库蠓等节肢昆虫叮咬反刍动物导致的传染病。全世界现已发现BTV有27种血清型,各血清型之间没有交叉保护作用,且病畜感染血清型不同或个体差异不同所表现的临床症状不同,给蓝舌病的防控和多价疫苗的研究带来了挑战。研发有效的蓝舌病检测诊断试剂盒对蓝舌病的防控意义重大。BTV的VP7蛋白具有群特异性抗原决定簇,能诱导机体产生免疫反应,故对VP7蛋白的研究尤为重要。本研究在分离鉴定一株BTV-14型毒株的基础上,进行VP7蛋白的真核表达,单克隆抗体的制备并初步建立竞争ELISA检测方法。1.BTV-14的分离与鉴定本研究对某羊养殖场疑似感染BT的个体采集血液样品进行病毒的分离和鉴定。将送检样品进行BTV抗体检测并接种BHK-21细胞进行盲传,对出现细胞病变（CPE）的样品进行针对S7基因和L2基因的RT-PCR检测、间接免疫荧光检测及中和试验。结果显示,样品检测结果显示部分样品呈现BTV抗体阳性,接种BHK-21细胞都产生了特异性的CPE,而且能被BTV-14标准阳性血清特异性中和,RT-PCR可扩增出长度为1080 bp的S7基因片段、850 bp和1581 bp的L2基因片段,将L2基因序列测序后通过BLAST检索NCBI的GenBank结果与BTV-14的序列相一致,说明我国新疆地区存在BTV-14。2.BTV-14的VP7蛋白的真核表达和单克隆抗体制备根据BTV-14的S7基因开放阅读框序列设计并合成一对特异性引物,将S7基因编码区克隆至pFastBacHTA载体中构建重组质粒,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组穿梭质粒,接着把重组穿梭质粒转染至sf9细胞中表达获得VP7重组蛋白。同时用蔗糖梯度离心法纯化BTV-14全病毒,按照免疫程序免疫Balb/c小鼠,选取效价最高的免疫小鼠在融合前三天加强免疫,细胞融合前夜制备饲养细胞,取免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞融合。将真核表达的VP7蛋白作为筛选抗原,建立间接ELISA检测方法筛选阳性克隆,共筛选出4株能产生针对VP7蛋白抗体的杂交瘤细胞。3.蓝舌病毒竞争ELISA检测方法的初步建立把VP7作为包被抗原,制备的单抗作为竞争抗体建立BTV的c-ELISA检测方法。经优化反应条件设定为:抗原包被浓度为1 μg/孔;4℃包被过夜;5%BSA在37℃封闭2 h;待检血清5倍稀释;竞争单抗400倍稀释;酶标二抗5000倍稀释,初步建立BTV的c-ELISA方法。该方法具有特异性,可区分口蹄疫（FMD）、小反刍兽疫（PPR）抗体阳性血清样品。综上所述,本研究分离到一株蓝舌病毒并鉴定为14型,随后扩增BTV-14的S7基因编码区,经sf9细胞表达获得VP7蛋白作为包被抗原,筛选到4株能识别VP7蛋白的单克隆抗体,初步建立蓝舌病的c-ELISA检测方法,为研制蓝舌病的临床快速诊断方法奠定了基础。
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