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猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是猪烈性传染病猪瘟(Classical swine fever,CSF)的病原菌,由于猪瘟具有高发病率和死亡率,能对养猪业造成巨大损失的特点,而被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)和陆生动物法典列为法定报告的动物传染病。CSFV的非结构蛋白 NS3具有多种蛋白酶功能。研究发现,NS3能够与CSFV RNA的3’UTR以及IRES结合,促进病毒的转录和翻译。NS2-3复合体能够影响病毒的复制和病毒粒子组装。此外,NS3蛋白在细胞中的积累,会导致细胞病变。NS3由于能够引起宿主产生高水平的中和抗体,因而也被认为是能够替代E2的潜在疫苗研发对象。 本文为研究NS3蛋白对宿主的致病机制以及与宿主细胞蛋白的相互作用,采用酵母双杂交技术,对猪外周血单核细胞中能与NS3蛋白进行互作的蛋白进行筛选,得到如下研究结果: (1)利用RT-PCR扩增得到NS3基因,并成功构建pGBKT7-NS3重组诱饵质粒。将重组质粒转化 Y2HGold酵母感受态细胞,经过检测表明其无自激活作用,并且对酵母细胞没有毒性作用。对Y2HGold(pGBKT7-NS3)表达蛋白用Western Blot方法进行检测,能够得到约100 kDa产物,说明NS3在酵母细胞中能够表达,能够用于文库筛选。 (2)对猪外周血进行分离,得到单核细胞,提取其总 RNA。利用 SMART技术合成cDNA第一链和ds cDNA。利用CHROMA SPIN+TE-400对ds cDNA进行纯化,去除200 bp以下的短片段后,与pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,制备cDNA文库。经过检测,发现文库滴度为1.2×107cfu/mL,文库库容为6.0×108。随机挑取23个酵母菌落进行文库多态性检测,经过电泳检测发现,文库插入片段分布在500 bp~3000 bp之间,其中主要集中在1000 bp~1500 bp,重组率为91%。 (3)利用 pGBKT7-NS3诱饵质粒对猪外周血单核细胞 cDNA文库进行筛选后,共获得8个与 NS3存在潜在互作的目的蛋白,分别为 HAUS2,CTSV,β-Actin,PSMB10,LDHB,MARC1,ASB3和ETFA。