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乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是全球公共卫生问题,尤其是在实验设备匮乏的发展中国家和地区。HBV和HCV核酸检测是诊断和疗效检测的最佳方法,国内大、中型医院普遍使用荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),然而,FQ-PCR操作流程烦琐,试剂、仪器均较昂贵,对操作人员的技术要求高,不适用于在医疗设备匮乏的场所进行操作。本研究建立了依赖钙黄绿素和羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)的可视化环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以利于在实验设备匮乏的环境下进行HBV和HCV检测。第一部分应用环介导等温扩增技术可视化检测乙型肝炎病毒目的:建立可视化检测HBV的LAMP方法。方法:首先,根据NCBI网站上公布的HBV S区段保守序列设计LAMP引物。第二,收集临床血清样本,分别按照试剂盒法和煮沸法提取DNA,用FQ-PCR对病毒进行定量。第三,对反应条件进行优化,通过对非特异模板扩增实验和内切酶消化实验以验证扩增特异性;通过检测试剂盒提取后倍比稀释的HBV模板以评价LAMP的灵敏性;通过LAMP和PCR扩增煮沸血清后结果的比较,以评价LAMP的抗干扰性。同时,根据电泳结果比较依赖SYBR Green I的和依赖HNB的可视化检测效果。最后,用LAMP和PCR扩增临床样本,用SPSS 17.0统计学软件分别与FQ-PCR(金标准)进行比较。结果:经过一系列预实验,建立了最适LAMP反应条件,LAMP特异性高,没有产生非特异性扩增。无论使用哪种核酸提取方法,LAMP灵敏性均为10拷贝/管,由此可得出LAMP的抗干扰性较好。依赖HNB可视化检测的效果和SYBR Green I、电泳分析相当,却不似染料SYBR Green I需要开盖加入而造成气溶胶污染。另外,lamp对于煮沸血清的检测结果和fq-pcr没有统计学差异(p>0.05),且一致性较好(kappa=0.762)。然而,pcr对于煮沸血清的检测结果和fq-pcr有统计学差异(p<0.05),且一致性较差(kappa=0.186)。结论:本研究针对hbvs区段,设计了针对我国主要的四种hbv基因型lamp通用引物,通过设计环引物,提高了扩增效率。另外,使用煮沸血清为模板,简化了操作流程,从而建立了依赖hnb可视化检测hbv的lamp技术。第二部分应用反转录环介导等温扩增技术可视化检测丙型肝炎病毒目的:建立可视化检测hcv的rt-lamp方法。方法:首先,收集并用fq-pcr(金标准)检测75例临床样本。根据9种hcv基因亚型的5’非编码区(5’utr)设计通用rt-lamp引物。然后,通过比较传统rt-lamp系统和加入taqdna聚合酶的系统以优化体系,通过非特异模板扩增实验以评价其特异性,通过rt-lamp和rt-pcr同时检测倍比稀释的hcv模板以评价其灵敏性。用电泳分析扩增情况,同时用钙黄绿素和hnb可视化检测产物。最后,用rt-lamp和rt-pcr检测临床样本,用spss17.0统计学软件分别与fq-pcr进行比较。结果:结果表明向传统rt-lamp体系中加入taqdna聚合酶可提高20min的扩增效率。rt-lamp的特异性好,没有非特异性扩增现象。经检测稀释模板,rt-lamp的灵敏性为10iu/管,比rt-pcr高10倍。另外,钙黄绿素和hnb的可视效果与电泳分析相一致。经检测75例临床样本,rt-lamp显示了和fq-pcr较好的一致性(p>0.05,kappa=0.762)。结论:本研究针对hcv5’utr区段,设计了检测hcv9种基因亚型的rt-lamp通用引物,建立了依赖钙黄绿素或hnb可视化检测hcv的rt-lamp技术。第三部分应用反转录等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测目的:建立对HCV 1b和2a基因型分型的RT-LAMP方法。方法:首先,收集74例阳性临床采样标本并用FQ-PCR方法分型和定量。第二,分别根据HCV 1b和2a序列各自的5’UTR设计相应的RT-LAMP引物。第三,利用与非特异模板扩增实验和酶切实验以评价各引物的特异性。第四,扩增倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素的可视化方法判定结果。最后,对所有临床样本分别用HCV 1b和2a分型引物进行两组平行反应,应用SPSS 17.0统计学软件比较RT-LAMP和FQ-PCR的一致性。结果:结果表明RT-LAMP引物特异性好,于非特异模板无交叉反应且HCV1b和2a型酶切产物大小与预期相一致。RT-LAMP法最低检测HCV 1b和2a的灵敏度为100 IU/mL,且依赖钙黄绿素的可视化方法和电泳分析相一致。经对临床样本进行平行实验,RT-LAMP检测HCV 1b型的阳性率为97.37%,检测HCV 2a型的阳性率为94.44%。SPSS 17.0统计学软件表明RT-LAMP和FQ-PCR没有统计学差异(P>0.05)。结论:本研究通过比较多组HCV基因序列,设计了两套分型引物,建立了依赖钙黄绿素可视化分型检测HCV的RT-LAMP技术。