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研究背景:胃癌是世界范围内第五位常见恶性肿瘤和癌症死亡第三大原因。胃癌由于缺乏分子标志物,诊断通常在晚期,导致5年生存率较低,约20-30%。目前,传统化疗仍然是晚期胃癌治疗的主要方式。阿霉素(Doxorubicin,Adriamycin,ADR)联合氟尿嘧啶、顺铂、紫杉醇和丝裂霉素等被广泛用于治疗包括胃癌在内的多种恶性肿瘤。然而,阿霉素耐药性仍然是胃癌治疗面临的难题。外泌体(exosome,Exo)是一类直径约30-100 nm、具有双层脂质膜的细胞外囊泡,内含蛋白质、核酸和脂质等多种生物活性成分,可被邻近或远端受体细胞摄取,进而影响受体细胞的生物学行为。外泌体中的核酸成分近年来最受研究者们重视,包括DNA、m RNA、长非编码RNA(Lnc RNAs)、micro RNA(mi RNAs)和环状RNA(circ RNAs)等,尤其是mi RNAs。外泌体mi RNAs可以防止被RNases降解,有研究表明,肿瘤细胞分泌的外泌体通过传递mi RNA,影响受体细胞增殖和侵袭转移能力及化疗耐药性。Micro RNA-501-5p(mi R-501)是新发现的一种oncomi R。有报道mi R-501在肝细胞癌、肺腺癌、宫颈癌和胃癌组织中均显著高表达,且其表达增高与肺腺癌和宫颈癌的进展和胃癌不良预后密切相关。我们此前的研究已证实,mi R-501可直接靶向下调BH3-like motif-containing protein(BLID,cell death inducer)促进胃癌阿霉素耐药性和增殖、迁移和侵袭能力。但mi R-501是否可通过外泌体转运以及外泌体mi R-501对胃癌阿霉素耐药的作用和机制尚不清楚。目的:(1)验证外泌体mi R-501与BLID的调控关系。(2)体内外实验探讨外泌体mi R-501通过下调BLID促进胃癌阿霉素耐药的机制。方法:(1)用去除外泌体血清培养SGC7901/ADR及SGC7901细胞,超速离心(120000×g/分钟)的方法分离提取外泌体(分别标记为ADR Exo及7901 Exo);透射电镜、纳米颗粒追踪分析技术和Western blot方法验证所提取外泌体的可靠性。(2)利用红色荧光染料PKH26标记ADR Exo,与蓝色荧光染料DAPI标记细胞核的SGC7901细胞共孵育,激光共聚焦显微镜下观察SGC7901细胞摄取红色荧光标记的外泌体情况。将转染红色荧光标记的mi R-501 mimic(Cy3-mi R-501 mimic)的SGC7901/ADR细胞铺于Transwell小室(孔径=0.4μm)的上室,与下室的SGC7901细胞共培养,荧光显微镜观察SGC7901细胞中红色荧光的情况。(3)慢病毒表达载体mi RNA inhibitor无关序列(NCi)、mi R-501 inhibitor(501KD)和BLID过表达(BLID)感染SGC7901细胞,分别与ADR Exo共孵育。7901 NCi与PBS共孵育作为对照。SGC7901细胞与外泌体抑制剂GW4869处理或利用Lipofectamine2000转染mi RNA inhibitor无关序列(NCi)、mi R-501 inhibitor(501i)及BLID的小干扰RNA(si RNA)(si BLID)与mi R-501 inhibitor共转染(501i+si BLID)的SGC7901/ADR细胞共培养。分别用Taqman探针法和SYBR Green染料法q RT-PCR检测mi R-501和BLID m RNA的表达水平,Western blot检测BLID和下游的caspase-9、caspase-3、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平。CCK-8实验检测阿霉素的半数致死剂量(IC50)。分别用流式细胞术、克隆形成和Transwell小室实验检测外泌体mi R-501对细胞凋亡、增殖和迁移侵袭能力的影响。(4)20只裸鼠随机分为4组,每组5只,分别在皮下注射1×106个慢病毒表达载体感染的SGC7901细胞,分别为7901 NCi 2组、7901 501KD和7901 BLID。皮下移植瘤体积达到50 mm3时,7901 NCi、7901 501KD和7901 BLID组分别瘤内注射ADR Exo(50 ug),注射3次持续1周,对照组7901 NCi瘤内注射等体积PBS。皮下肿瘤继续生长体积达到100 mm3时,尾静脉注射阿霉素(5 mg/kg),3次/周,持续2周。裸鼠处死取出皮下移植瘤。部分组织用于提取RNA,检测mi R-501和BLID m RNA的表达;部分组织用于检测BLID蛋白和其下游caspase-9、caspase-3及其p-Akt蛋白表达。结果:(1)超速离心法提取胃癌细胞SGC7901和SGC7901/ADR分泌的外泌体,透射电镜下可见圆形或椭圆形,直径30-100 nm的脂质双层膜囊泡;纳米颗粒追踪分析检测发现直径100 nm左右囊泡居多,7901 Exo及ADR Exo浓度经计算后分别为4.6×108个囊泡/ml和2.8×109个囊泡/ml;Western blot检测显示所提取囊泡表达外泌体标志物CD63、CD81和HSP70。以上结果均证明外泌体提取成功。(2)q RT-PCR结果显示ADR Exo中mi R-501的水平是7901 Exo的2.54±0.31倍(P<0.01)。激光共聚焦显微镜下可见外泌体被受体细胞SGC7901摄取,荧光显微镜观察mi R-501可以被外泌体从SGC7901/ADR转运到SGC7901。SGC7901细胞与ADR Exo共孵育后mi R-501表达水平显著增高且阿霉素耐药性增加(P<0.01)。(3)7901 NCi、7901 501KD和7901 BLID细胞分别与ADR Exo共孵育,7901 NCi细胞与等体积PBS共孵育作为阴性对照。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,7901NCi和ADR Exo共孵育后mi R-501的表达水平显著增加(P<0.01)。相反,BLID m RNA和蛋白水平显著降低(P<0.05),同时,对阿霉素耐药性显著增加(P<0.05)。7901 501KD和7901 BLID细胞与ADR Exo共孵育后,无论是mi R-501水平还是BLID m RNA及蛋白水平以及阿霉素耐药性和对照组相比均无明显差异(P>0.05)。SGC7901细胞与外泌体抑制剂GW4869处理的SGC7901/ADR细胞(7901+ADR GW4869)共孵育后,与DMSO处理的SGC7901/ADR(7901+ADR DMSO)和SGC7901共孵育相比,mi R-501表达水平显著下降(P<0.05)。SGC7901与GW4869处理的或转染mi R-501 inhibitor的SGC7901/ADR细胞共孵育,7901+ADR DMSO和7901+ADR NCi、7901+ADR 501i+si BLID作为对照组。q RT-PCR和Western blot结果显示,与对照组相比,7901+ADR GW4869和7901+ADR 501i组BLID m RNA和蛋白水平均明显增高(P<0.05)。CCK-8结果表明,与对照组相比,7901+ADR GW4869和7901+ADR 501i组对阿霉素的敏感性增加(P<0.05)。(4)7901 NCi与ADR Exo共孵育后,凋亡率明显低于对照组(P<0.01)。ADR Exo逆转了7901 501KD和7901 BLID细胞的凋亡率,与7901 NCi+PBS组相比无显著差异(P>0.05)。SGC7901细胞与ADR GW4869共孵育后凋亡率比7901+ADR DMSO组增加了31.20%±1.65%(P<0.01)。同时,7901+ADR 501i组的凋亡率与7901+ADR NCi和7901+ADR 501i+si BLID组相比显著增加(P<0.05)。另外,Western blot结果显示7901 NCi+ADR Exo组的cleaved caspase-9和caspase-3蛋白表达低于7901 NCi+PBS组。其他两组与7901 NCi+PBS组相比无明显差异。相反,与对照组相比,7901+ADR GW4869组和7901+ADR 501i组的cleaved caspase-9和caspase-3蛋白水平明显升高。(5)7901 NCi细胞与ADR Exo共孵育后,细胞集落形成数明显增多,Transwel小室迁移实验(无基质胶包被)和侵袭实验(有基质胶包被)结果显示穿膜细胞数显著增加(P<0.05)。7901 501KD和7901 BLID细胞与ADR Exo共孵育后与7901NCi+PBS组相比,细胞集落形成数和穿膜细胞数均无明显差异。然而,SGC7901细胞与GW4869处理或转染501i的SGC7901/ADR细胞共孵育后,细胞集落形成数和穿膜细胞数均显著低于各自的对照组(P<0.05)。Western blot结果显示7901NCi+ADR Exo组的p-Akt蛋白表达水平显著高于7901NCi+PBS组。7901 501KD和7901 BLID与ADR Exo共孵育后,p-Akt蛋白表达水平与对照组相比无显著差异。7901+ADR GW4869组和7901+ADR 501i组的p-Akt蛋白表达与对照组相比均显著减少。(6)体内实验证实7901 NCi组的皮下移植瘤生长速度比7901 501KD和7901 BLID组快(P<0.01)。瘤内注射ADR Exo后7901 NCi组的生长速度快于其他三组,7901501KD和7901 BLID组瘤内注射ADR Exo后生长速度与对照组接近。尾静脉注射阿霉素后,7901 NCi+ADR Exo+ADR组的皮下移植瘤的体积显著大于7901NCi+PBS+ADR、7901 501KD+ADR Exo+ADR和7901 BLID+ADR Exo+ADR组(P<0.01)。7901 501KD+ADR Exo+ADR和7901 BLID+ADR Exo+ADR组的皮下移植瘤体积与对照组相比无明显差异。与对照组相比,7901 NCi+ADR Exo+ADR组的mi R-501表达水平显著升高,BLID m RNA和蛋白水平显著降低,其下游的cleaved caspase-9和caspase-3蛋白水平降低,p-Akt蛋白水平增加。结论:(1)体内外实验表明外泌体mi R-501可促进胃癌增殖、迁移和侵袭能力以及阿霉素耐药性,抑制凋亡。(2)外泌体mi R-501通过下调BLID表达,使caspase-9/-3通路失活抑制细胞凋亡,另外促进Akt磷酸化,进而促进胃癌阿霉素耐药性。外泌体mi R-501可能成为胃癌诊断潜在标志物和胃癌治疗新的候选靶点。