论文部分内容阅读
本文对于变性泡介导的链交换扩增(Strand Exchange Amplification,SEA)引物设计规则和快速SEA(accelerated SEA,ASEA)初步应用和核酸杂交特异性进行初步研究,主要的研究内容与结论如下:1.SEA引物设计策略:利用一系列Tm值的肺炎支原体引物研究引物Tm值与反应温度的最优组合;通过具有不同Tm值差异的沙眼衣原体和家猪引物的扩增效率研究引物Tm差异对扩增效率的影响;设计肺炎支原体和沙眼衣原体引物研究G/C含量对扩增效率的影响;根据沙眼衣原体和单增李斯特菌引物的扩增效率研究引物自身互补和3’端互补对扩增效率的影响;根据金黄色葡萄球菌的扩增效率确定引物Tm值和3’末端G/C含量的优先级。结果:引物Tm值及反应温度均为61℃时,SEA有最高的扩增效率;Tm值差异最小的引物对的阈值时间(Threshold time,Tt)值最低,而Tm值差异最大的引物对的Tt值最高;3’端G/C含量较高的引物表现出较低的Tt值;互补位点的数目与Tt值呈正相关,引物拥有的总潜在互补位点最少,Tt值最低;Tm值和Tm值的差异应优先于3’端G/C含量。结论:SEA引物设计应遵循以下原则:(1)引物Tm值应接近61℃;(2)引物Tm值差异不能超过1℃;(3)最后五个核苷酸内应至少具有两个G/C,而末端核苷酸则应为G/C;(4)避免引物自身互补和3’端互补;(5)上述因素的考虑优先顺序为自身互补和3’互补,Tm值和Tm值差异以及3’端CG含量。2.快速SEA(ASEA)检测方法研究:以肺炎支原体为靶标设计ASEA引物,并分别用短靶标和PCR产物评估灵敏度。通过SNP检测实验评估ASEA对单碱基突变的检测能力。设计嗜血支原体、猫疱疹病毒及犬疱疹病毒ASEA引物并评估灵敏度。结果:肺炎支原体引物对短靶标灵敏度为1.0×10-15 M,对于PCR产物灵敏度为1.0×10-14 M。ASEA检测方法能够检测到在1.0×10-12 M突变背景下含有1%的正确靶标。嗜血支原体引物灵敏度为1.0×10-15 M,猫疱疹病毒引物灵敏度为1.0×10-16 M,犬疱疹病毒引物灵敏度为1.0×10-15 M。结论:ASEA能够在15min内完成检测,同时灵敏度相比SEA提高100倍。3.核酸杂交特异性研究:通过反应吉布斯自由能预测,计算toehold探针和分子信标的鉴别因子,设计toehold分子信标并计算鉴别因子。以Let-7a为靶标研究突变位置及探针互补碱基个数对ΔΔG的影响。结果:toehold探针鉴别因子最大值为2486,中位数为621。分子信标鉴别因子最大值为21.25,中位数为5.71。toehold分子信标鉴别因子最大值为693,中位数为29.92。对于Y字型探针,当突变位置为第5位和第18位时,对反应ΔΔG影响最大,探针互补碱基个数对ΔΔG没有影响。结论:相比分子信标,toehold分子信标鉴别因子最大提升72.85倍;相比toehold探针,toehold分子信标杂交产率提高1.40倍。设计Y字型探针时,应将突变位点设计在杂交区域的中央位置。