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胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是肥胖、2 型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)和心脑血管疾病等代谢相关疾病的共同病理生理学特征。线粒体是细胞内脂肪酸氧化、ATP合成及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的主要部位,线粒体功能障碍(mitochondrial dysfunction)在胰岛素抵抗的发生发展中起到关键作用。肝脏是胰岛素的主要靶器官,也是维持血糖稳态和能量物质代谢的主要器官。肝胰岛素抵抗在全身胰岛素抵抗的发生、发展中起着举足轻重的作用。研究肝胰岛素抵抗的线粒体机制,积极开发线粒体靶向药物,对于防治T2DM等代谢性疾病具有重要的理论意义和应用价值。环烯醚萜类化合物京尼平(genipin)是传统中药栀子的主要有效成分,具有保肝利胆、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用。近年研究发现,京尼平可抑制线粒体解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP2)活性,提高ATP水平,促进胰岛β细胞分泌胰岛素,降低血糖,治疗T2DM。但京尼平在胰岛素抵抗,尤其是肝胰岛素抵抗中的作用及机制仍未阐明。本研究通过观察京尼平在老年大鼠肝脏、棕榈酸处理的肝细胞、及UCP2过表达肝细胞中对线粒体功能及胰岛素敏感性的影响,从整体、离体、分子水平探索京尼平改善肝胰岛素抵抗的线粒体机制及分子靶点,为T2DM的早期防治及新药开发提供重要的理论依据和实验基础。第一部分京尼平改善老年大鼠胰岛素抵抗的作用及机制研究目的:衰老是胰岛素抵抗的独立危险因素之一。线粒体功能障碍和氧化应激是衰老相关胰岛素抵抗的重要特征。本研究通过观察京尼平对老年大鼠胰岛素敏感性及肝线粒体功能的影响,从整体水平探讨京尼平改善肝胰岛素抵抗的线粒体机制。方法:采用健康雄性SD大鼠,分为青年对照组(3月龄)和老年组(18月龄)。将老年组再随机分为京尼平处理组(ip.京尼平25mg.kg-1.d-1)和老年对照组(ip.等体积生理盐水)。给药12d后,各组随机取6只大鼠行静脉胰岛素耐量实验(ivITT),绘制胰岛素耐量曲线,以曲线下面积(AUCITT)和血糖自然对数下降的斜率(KITT)表示胰岛素抵抗程度。其余大鼠称重,断头处死,取血测定生化指标;取脂肪称重,计算内脏脂肪系数;取肝组织,分别用于形态学观察,糖原含量及丙二醛(MDA)含量测定;提取新鲜肝线粒体,测定线粒体膜电位(MMP)、ROS及ATP水平。结果:(1)京尼平减轻老年大鼠胰岛素抵抗:老年大鼠体重、内脏脂肪系数、甘油三脂、血胰岛素水平均较青年对照组明显升高;京尼平处理后,各指标均明显回降。ITT结果显示,与青年对照组相比,老年对照组大鼠AUCITr明显升高(P<0.01),KITT明显降低(P<0.01);京尼平干预后,老年大鼠AUCITr明显回降(P<0.05),KITT明显回升(P<0.05)。(2)京尼平减轻老年大鼠肝胰岛素抵抗:老年大鼠肝糖原含量较青年对照组明显降低(P<0.05);给予京尼平后,肝糖原含量明显回升(P<0.05)。形态学观察结果显示,老年大鼠肝细胞内糖原颗粒减少,脂肪沉积增加;京尼平处理后,糖原颗粒增多,脂肪沉积明显减轻。说明京尼平能够改善肝脏糖脂代谢,提高肝胰岛素敏感性。(3)京尼平减轻肝氧化应激及线粒体功能障碍:老年大鼠肝组织MDA水平较青年对照组显著升高(P<0.01);京尼平使其MDA水平下降了 34%(P<0.01)。老年大鼠肝线粒体ROS水平明显升高(P<0.01),MMP(P<0.05)和ATP(P<0.01)水平明显降低;京尼平干预后,肝线粒体ROS水平显著降低(P<0.01),MMP(P<0.05)和ATP(P<0.01)水平明显提高。电镜结果显示,老年大鼠肝线粒体肿胀,结构欠清晰:京尼平处理后线粒体形态有所改善。(4)京尼平抑制肝线粒体UCP2蛋白表达:Western blotting结果显示,老年大鼠肝脏UCP2蛋白表达明显增加,而京尼平显著抑制了 UCP2蛋白表达。结论:京尼平能够改善衰老相关的胰岛素抵抗,其机制可能与减轻线粒体氧化应激、抑制UCP2表达,提高肝线粒体功能有关。第二部分京尼平改善棕榈酸诱导肝细胞胰岛素抵抗的作用及机制研究目的:血浆自由脂肪酸(free fatty acid,FFA)升高是导致胰岛素抵抗的决定性因素。线粒体功能障碍在FFA诱导的肝胰岛素抵抗中起到关键作用。本研究通过建立饱和脂肪酸棕榈酸(pamitic acid,PA)诱导的L02肝细胞胰岛素抵抗模型,在离体水平进一步探讨京尼平改善肝细胞胰岛素抵抗的线粒体机制。方法:以不同浓度PA处理L02细胞不同时间,检测胰岛素刺激的糖原合成和葡萄糖消耗、细胞存活率及细胞内脂肪沉积,建立PA诱导的L02肝细胞胰岛素抵抗模型。以0.25mM PA处理L02细胞不同时间,检测线粒体功能指标ROS、MMP、同孵育L02细胞24h,检测胰岛素敏感性、线粒体功能及胰岛素信号分子的变化,观察京尼平对PA诱导的胰岛素抵抗和线粒体功能障碍的影响。此外,采用鲁米诺-H202-钴离子化学发光系统,检测不同ATP变化,探明PA诱导肝胰岛素抵抗的线粒体机制。以不同浓度京尼平与PA共浓度京尼平对H202发光信号的直接影响,评价京尼平的体外抗氧化作用。结果:(1)PA诱导L02肝细胞胰岛素抵抗模型的制备:0.25mM PA作用24h,胰岛素刺激的糖原合成和葡萄糖消耗明显降低,细胞内脂肪沉积增加,成功诱导L02肝细胞胰岛素抵抗。(2)PA导致L02肝细胞线粒体功能障碍:0.25mM PA处理L02细胞不同时间后,ROS水平在8h,16h,24h时间点均极显著性升高,呈现剂量依赖性;MMP和ATP水平在16h、24h时间点均显著下降,8h时间点无明显变化。(3)京尼平减轻PA诱导的L02肝细胞胰岛素抵抗:在PA诱导的L02肝细胞胰岛素抵抗模型中,50μM和100μM京尼平显著增加了胰岛素刺激的肝细胞糖原合成和葡萄糖消耗,并呈现剂量依赖性。(4)京尼平减轻PA导致的L02肝细胞线粒体功能障碍:0.25mM PA处理L02肝细胞24h,导致细胞内ROS水平明显升高,MMP和ATP水平显著下降;50μM和100μM京尼平干预后,细胞内ROS水平显著降低,MMP和ATP水平升高,并呈现剂量依赖性。(5)京尼平减轻PA导致的L02肝细胞胰岛素信号损害:PA处理24h,显著增加了 L02肝细胞SAPK/JNK的磷酸化,并抑制了胰岛素刺激的Akt磷酸化。100μM京尼平抑制了 PA诱导的SAPK/JNK的过度磷酸化,恢复了胰岛素刺激的Akt磷酸化。(6)京尼平体外抗氧化作用:京尼平剂量依赖性的抑制H2O2信号,说明京尼平能够在体外直接清除ROS,可作为一种抗氧化剂发挥作用。结论:京尼平通过对抗氧化应激,改善线粒体功能障碍,恢复胰岛素信号转导,减轻了 PA诱导的肝细胞胰岛素抵抗。第三部分京尼平对UCP2过表达肝细胞线粒体功能及胰岛素敏感性的影响目的:UCP2是线粒体内膜上的“质子漏”蛋白,可使氧化磷酸化脱偶联,ATP合成减少。正常肝细胞不表达UCP2,但肥胖、T2DM及非酒精性脂肪肝可使肝细胞UCP2表达上调,提示UCP2参与肝胰岛素抵抗的发生。我们观察到,京尼平改善老年大鼠肝胰岛素抵抗与UCP2表达下调有关。本研究通过构建UCP2过表达张氏肝细胞模型,观察京尼平对UCP2过表达肝细胞胰岛素敏感性及线粒体功能的影响,进一步探索京尼平在肝细胞胰岛素抵抗中的作用与UCP2的相关性。方法:将含有人UCP2 cDNA全长的重组质粒(pcDNA3.1-hUCP2)转染张氏肝细胞,pcDNA3.1空载体作为对照,构建UCP2过表达张氏肝细胞株。以50μM京尼平处理正常肝细胞及UCP2过表达肝细胞,设立相应对照组,检测胰岛素刺激的糖原合成、MMP及ATP水平变化。结果:(1)UCP2过表达张氏肝细胞株构建:免疫细胞化学结果显示,UCP2过表达组染色颗粒较对照组和空载体组明显增多,染色加深。Western blotting结果显示,UCP2相对表达量明显增加,约为对照组的1.6倍。(2)京尼平减轻UCP2过表达肝细胞的胰岛素抵抗:与正常对照组相比,UCP2过表达组胰岛素刺激的糖原合成明显降低;京尼平使过表达细胞胰岛素刺激的糖原合成增加20%(P<0.01),显著提高了 UCP2过表达细胞对胰岛素的敏感性。(3)京尼平改善UCP2过表达肝细胞的线粒体功能:与正常对照组相比,UCP2过表达组MMP和ATP水平均显著降低;50μM京尼平处理明显提高了过表达细胞MMP和ATP水平。结论:UCP2过表达导致肝细胞胰岛素抵抗和线粒体功能障碍;京尼平可能通过抑制UCP2,改善线粒体功能,提高肝细胞胰岛素敏感性。