前言　　疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播引起的一种感染性寄生原虫疾病。在国内外，疟疾依然是高发的感染性寄生虫病。由于疟原虫对抗疟疾药品耐药性和蚊虫对杀虫剂抗药性的产生及扩散，人类与疟疾之间的斗争日趋激烈，研制安全有效的疟疾疫苗成为控制疟疾的重要途径和迫切需要。　　蛋白的磷酸化和去磷酸化在细胞中是调节酶活性的基础形式。蛋白激酶(proteinkinases，PK)可催化蛋白的磷酸化反应，几十年来受到普遍关注，细胞信号转导的重要发现多来自PK的研究，但不可忽视细胞的磷酸化水平同时受控于PK和蛋白磷酸酶(proteinphosphatase，PP)。PP组成了一个与PK相平行的结构复杂多样的酶家族。疟原虫的生长发育及在宿主体内发生的一系列变化都依赖于信号传导途径，而此途径大部分都需要蛋白磷酸化。鉴于蛋白磷酸酶在疟原虫生活周期中重要且不可替代的作用，可能是抗疟的有效靶位。最近发现疟原虫中存在特异性蛋白磷酸酶，进一步说明蛋白磷酸酶可能在有性发育中的重要作用。　　本实验以致死型约氏疟原虫PY04697、PY02284、PY02322候选蛋白磷酸酶作为研究对象，应用生物信息学方法对抗原的各种参数进行分析，从中筛选出所需基因片段，有目的地进行扩增，构建相应原核表达载体，进行动物免疫并通过间接免疫荧光和Real-timePCR观察其分布，以期筛选出优势靶抗原，为疟疾传播阻断疫苗的研发提供理论基础和实验室依据。　　方法　　一、约氏疟原虫PY04697、PY02284、PY02322基因片段的获取　　1、基于疟原虫数据库对3个候选蛋白磷酸酶(PY04697、PY02284、PY02322)进行生物信息学分析。　　应用生物信息学手段，对致死型约氏疟原虫PY04697、PY02284、PY02322基因编码产物的抗原决定簇、功能区域等进行预测分析。　　2、约氏疟原虫基因组DNA的提取　　用致死型约氏疟原虫感染Ba1b/c鼠，感染第三天小鼠眼球取血，按照天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒说明书，提取疟原虫基因组DNA。　　3、PCR方法从提取的基因组中扩增PY04697、PY02284、PY02322基因片段　　4、凝胶纯化PCR产物　　将PCR产物琼脂糖凝胶电泳，切下琼脂糖凝胶电泳后含目的片段的胶块，按照天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的回收。　　5、原核表达载体的构建及阳性克隆的鉴定　　将所得的目的片段及PET32a载体用限制性核酸内切酶BamHⅠ及XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶屯泳后分别回收所需目的片段及开环的PET32a载体，将两者连接。挑取平板上生长的可疑阳性菌落进行增菌，质粒提取后用PCR鉴定并测序。　　二、利用原核表达系统进行重组蛋白表达及纯化　　将测序鉴定正确的质粒转入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达重组蛋白，经western验证正确后，收集蛋白样品，镍柱纯化。　　三、纯化重组蛋白免疫动物及免疫血清的抗体滴度分析　　1、动物的免疫　　6～8周龄Ba1b/c雌性小鼠30只，分4组，每组5只，1～3组分别皮下注射三个候选蛋白磷酸酶重组蛋白（50μg/鼠），第4组为PBS对照组，两周以后加强免疫一次，共免疫三次。　　2、免疫小鼠血清的收集及血清中抗体IgG的检测　　在每次免疫两周后，小鼠尾静脉取血，提取并保存血清。用ELISA方法检测血清中IgG抗体及其亚类的浓度。　　四、间接免疫荧光实验　　将这3个候选蛋白磷酸酶重组蛋白免疫小鼠三次后获得血清作为抗体，利用间接免疫荧光，确定3个候选蛋白磷酸酶能否与约氏疟原虫体表面天然蛋白发生阳性反应。　　五、Real-timePCR检测候选蛋白磷酸酶在P.y17XL疟原虫各阶段的基因表达　　提取疟原虫环状体，滋养体，裂殖体和配子体阶段RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，扩增PY04697、PY02284、PY04697mRNA，确定三种酶在疟原虫这些发育阶段表达情况。　　六、统计学分析　　所有数值以均数±标准差（(X)±SD）表示，采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析，组间比较采用单因素方差分析（Bonferroni校正），P＜0.05表示差异有统计学意义。　　实验结果　　一、约氏疟原虫PY02284、PY02322、PY04697基因片段的获取　　1、生物信息学分析　　采用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/及http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl在线预测网站对致死型约氏疟原虫候选蛋白磷酸酶基因PY02284、PY02322、PY04697编码蛋白的功能区域和抗原决定簇进行预测，选取抗原决定簇较集中的功能区域。　　2、PCR方法扩增PY02284、PY02322、PY04697基因片段　　1×107P.y17XL疟原虫感染的红细胞经腹腔感染BALB/c小鼠，于感染后第3天收集外周血，采用Trizol方法，分离外周血感染红细胞中疟原虫RNA，并将RNA反转录为cDNA(PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser,Takara)。然后，以cDNA为模板，扩增3个候选蛋白磷酸酶的目的基因。　　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，获得大小约为927bp(PY02284)、528bp(PY02322)、402bp(PY04697)的产物条带，与预期结果一致。　　3、原核表达质粒pET32a/PY02284、pET32a/PY02322、pET32a/PY04697的鉴定　　将扩增的DNA片段插入pET32a内，构建表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21感受态菌中，经PCR验证菌体DNA。提取PCR鉴定阳性菌体的质粒，测序鉴定3个候选蛋白磷酸酶基因的扩增序列均正确，表明候选蛋白磷酸酶表达载体均已成功构建。　　二、重组蛋白的表达和纯化　　测序鉴定正确的质粒，转化入大肠杆菌BL21宿主菌，经Ni-NTAHisbindResins方法纯化表达的重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，最后经Western-blot验证目的蛋白正确性，即pet32a+PY02284(53KDa)，pet32a+PY02322(44KDa)，pet32a+PY04697(38KDa)。结果显示:3个候选蛋白磷酸酶重组蛋白均已成功表达并收获纯化蛋白。　　三、重组蛋白免疫原性的检测　　采用ELISA方法检测免疫血清抗体滴度。结果显示3个候选磷酸酶重组蛋白均具有良好的免疫原性。　　四、间接免疫荧光实验　　将这3个候选磷酸酶重组蛋白免疫小鼠三次后获得血清作为抗体，间接免疫荧光显示这3个蛋白磷酸酶能识别约氏疟原虫表面分布的天然蛋白，也说明这3个重组蛋白抗原中保留着天然虫体抗原的表位。　　五、Real-timePCR检测候选蛋白磷酸酶在P.y17XL疟原虫各阶段的基因表达　　Real-timePCR的结果显示，PY02284、PY04697和PY02322mRNA在疟原虫的环状体，滋养体，裂殖体和配子体段均有表达，且均在配子体阶段表达较多。　　结论　　1、成功构建了PY02284、PY04697和PY02322原核表达载体并表达蛋白。　　2、动物实验和IFA表明，约氏疟原虫PY02284、PY04697、PY02322截短蛋白具有良好的免疫原性。　　3、Real-timePCR显示，PY02284、PY04697和PY02322mRNA在疟原虫配子体阶段表达较多。