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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是我国养猪业中重要的传染病之一，造成了巨大的经济损失。目前防控PRRS的主要手段为疫苗接种，但保护效果欠佳，且活疫苗存在安全隐患。RNA干扰是一种真核细胞固有的转录后基因沉默机制，也是先天性抗病毒机制，目前已发展成为有效的抗病毒感染策略。据报导，基因工程载体表达的人工微小RNA（artificial miRNA，amiRNA）能够作为有效的抗病毒手段，而人和小鼠的外排体(exosome)可以作为微小RNA的传递载体。 PRRSV主要感染猪的单核-巨噬细胞系统，特别是猪肺巨噬细胞(porcine alveolarmacrophage，PAM)。参与PAM感染的受体主要有CD163和唾液酸粘附素(sialoadhesin，Sn)或称CD169，前者是起主要作用的核心受体，后者是起次要作用的辅助受体。PRRSV基因组5和3非翻译区(untranslated region，UTR)含有高度保守的顺式调控序列，在病毒复制中发挥关键作用。为了研究控制PRRS的新策略，本研究构建了表达CD163、Sn和3UTR amiRNA的重组腺病毒(recombinant adenovirus，tAd)，并在细胞水平上研究rAd和外排体传导的amiRNA对PRRSV感染或复制的抑制作用。 为了研究CD163和Sn特异amiRNA对PRRSV感染的抑制作用，分别将两个amiRNA表达盒插入腺病毒载体，用重组载体转染AAV-293细胞，获得了两株rAd。流式细胞术和荧光显微镜观察结果显示，rAd能有效转导PK-15细胞，感染指数(MOI)为100时的转导效率可达100％;原代PAM细胞的转导效率很低，MOI为800时的转导效率仅达62％。Real-time RT-PCR检测结果显示，rAd转导细胞不仅能有效表达序列特异amiRNA，而且表达的amiRNA能通过外排体分泌到细胞外。Real-time RT-PCR和流式细胞术检测结果显示，rAd表达和外排体传送的amiRNA均能显著抑制CD163和Sn基因转录和蛋白表达，两种方式同时传递amiRNA的抑制作用更强。Real-time RT-PCR和病毒滴定结果显示，两种rAd转导和含两种amiRNA外排体孵育PAM细胞可显著降低PRRSV ORF7拷贝数和病毒滴度，抑制作用可持续96小时，对3株不同毒力PRRSV感染具有相同的抑制效果。这些研究资料表明，rAd是有效的amiRNA表达载体，猪细胞源外排体可作为amiRNA的传送载体，两种方式共同传送的CD163和Sn特异amiRNA对抑制PRRSV感染PAM细胞具有相加作用。 为了研究不同细胞源外排体向PAM细胞传送amiRNA的效率，将PRRSV3UTR特异amiRNA表达盒插入腺病毒载体，用重组载体转染AAV-293细胞，用获得的rAd分别转导猪肾细胞系PK-15、猪肺巨噬细胞系3D4/163、原代猪肾成纤维细胞PFC和子宫内皮细胞PEEC，从转导细胞培养液分离外排体。Real-time RT-PCR检测结果显示，rAd转导的4种猪源细胞不仅能有效表达序列特异amiRNA，而且表达的amiRNA能通过外排体分泌到细胞外，但不同细胞分泌amiRNA的能力有所差异。荧光显微镜观察结果显示，荧光染料标记的外排体能被上述4种类型细胞和原代PAM细胞有效摄取。Real-timeRT-PCR检测结果显示，原代PAM细胞能有效摄取4种细胞源外排体及其amiRNA，并具有时间和剂量依赖性。Real-time RT-PCR和病毒滴定试验结果显示，外排体传送的3UTR特异amiRNA对不同毒株PRRSV复制具有显著的抑制作用。这些研究结果表明，不同猪源细胞外排体均能向PAM细胞传递amiRNA，外排体传递的3UTR特异性amiRNA能显著抑制不同毒株PRRSV复制。