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目的:构建胰岛素分泌细胞筛选载体pTK-hyg<'r>16neo<'r>,作为干细胞分化后产生的胰岛素分泌细胞的筛选工具.同时探讨骨髓间质干细胞(mesenchymalstem cells,MSC)分化为胰岛素分泌细胞的可能性,寻找用于糖尿病的细胞移植替代治疗另一可能的种子细胞.方法:该实验分为两个部分:第一部分:利用基因工程技术构建胰岛素分泌细胞筛选载体pTK-hyg<'r>16neo<'r>.1.将phins15上的人胰岛素原基因用Hind Ⅲ切下后插入pTK-hyg<'r>载体的Hind Ⅲ位点,用Sac Ⅱ鉴定插入方向.选取和pTK-hyg<'r>cassette方向一致的克隆.建成质粒phins10/pTK-hyg<'r>.2.从质粒phins10/phyg<'r>中用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ切下2833bp的片段,仅含有一个Nco Ⅰ位点.此片段插入psp72克隆载体.建成psp2833质粒.3.将从pEGFPC2质粒用StuⅠ和DraⅠ切下的neo<'r>和其加尾信号1322bp平端插入psp2833的Nco Ⅰ位点,Avr Ⅱ鉴定插入方向.建成psp28neo<'r>.4.利用psp28neo<'r>和phins10/pTK-hyg<'r>质粒上的独有的BglⅡ和PciⅠ位点,将含neo<'r>的片断插入到phins10/pTK-hyg<'r>质粒,最终得到质粒载体pTK-hyg<'r>16neo<'r>(大小为16466bp),用Xho Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和AvrⅡ酶切质粒鉴定,得到的片断大小符合预期的长度.第二部分:骨髓间质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究.1.MSC的分离和培养扩增.无菌条件下取出SD大鼠的股骨,L-DMEM冲出骨髓,充分混匀后加入到细胞培养瓶中,补足培养基,置37℃,5％C0<,2>,80％湿度的培养箱中.3天后弃去悬浮的未贴壁细胞,换新鲜培养基.5-7天长梭形的MSC80％-90％融合,用胰酶消化后,按1:3传代,逐日观察细胞的生长情况,以上述方法进行传代扩增培养.2.MSC的鉴定.用β-巯基乙醇诱导MSC向神经元细胞分化,免疫组化鉴定显示:所分化的神经元样细胞表达神经干细胞的表面标记巢蛋白(Nestin).证明所培养的细胞是骨髓间质干细胞.3.MSC分化为类胰岛样细胞以及鉴定.MSC传至8-9代后,观察到部分细胞逐渐聚集成簇,形成球状细胞团,免疫荧光鉴定该球状体表达胰岛素抗原.结果:1.依据基因工程的原理成功的构建了胰岛素分泌细胞筛选载体pTK-hyg<'r>16neo<'r>.2.MSC体外长期培养后,形成球状细胞团,表达胰岛素分泌细胞的标记物胰岛素抗原,提示MSC有直接分化为胰岛素分泌细胞的可能性,可作为糖尿病细胞治疗的候选细胞.