杀线虫真菌的筛选及菌株DF09002的鉴定、发酵优化与产酶特性研究

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从海南五指山、阿里山、定安雷鸣等地采集到29份土壤样品,采用平板稀释法分离获得312株真菌。对分离的真菌进行杀线虫活性筛选,并对杀线虫活性最强的菌株DF09002进行了研究。主要研究内容如下:以南方根结线虫二龄幼虫为靶标线虫,首先对312株真菌进行活性筛选,结果发现共有22株具有抗线虫活性(校正死亡率在70%以上),活性菌株占总分离菌株的5.6%,其中菌株DF09002分离自定安雷鸣辣椒根际土样,其杀虫活性最强,校正死亡率达95.3%。复筛时其发酵液对根结线虫也具有较强的杀灭效果,24h内能将供试线虫全部杀死,稀释5倍后校正击倒率仍达68.5%。通过对菌株DF09002的形态特征、培养特征、rDNA-ITS序列测定及其系统发育分析的研究,将菌株DF09002归类为曲霉属黑色组曲霉黑曲霉集合体(genus of Aspergillus niger aggregate)中的一种。对菌株DF09002的最佳发酵条件和培养基组成进行研究。确定菌株DF09002最佳培养基组成及发酵条件为:土豆汁20%,黄豆粉1%,可溶性淀粉1.5%,葡萄糖2%,酵母膏0.75%;初始pH6.5,培养温度28℃,发酵时间以6天为宜,种龄36h,接种量为6%,250mL三角瓶装液量为75mL,摇床转速为200 r/min。对菌株DF09002产酶种类及特性进行研究,测出菌株DF09002可以产生几丁质酶、蛋白酶,不产生纤维素酶。采用福林-酚试剂法测得菌株DF09002的蛋白酶活力为41.63U/mL,采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)测定还原糖的方法测得菌株DF09002的几丁质酶活力为0.67U/mL。进一步实验证明,几丁质酶反应的最适温度为40℃,最适反应pH为6.8;蛋白酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为9.0。
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