目的:观察肥胖人群皮下和内脏脂肪组织中棕色化水平的改变;同时观察高脂喂养大鼠一般代谢状况、棕色脂肪活性及皮下脂肪的“棕色化”水平是否发生改变。方法:1 分别收集正常体重人群和行减重手术的肥胖人群腹壁皮下脂肪(sWAT)和网膜脂肪(vWAT),采用RT-PCR方法检测sWAT和vWAT中棕色基因的表达水平,并分析sWAT和vWAT中UCP1的mRNA水平与体重指数(BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMR-IR)的相关性。2 6周龄SD大鼠适应性喂养一周后,随机分为2组:(1)正常饮食组,给予普通饲料喂养;(2)高脂饮食组,给予高脂饲料喂养。饮食干预时间为18周。3 每周记录大鼠体重,第18周末进行空腹血糖、空腹血胰岛素、胰岛素抵抗指数(HOMR-IR)、腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)、腹腔注射胰岛素耐量试验(IPITT)等胰岛素抵抗相关指标检测,并行冷刺激试验。4 石蜡包埋大鼠肩胛间棕色脂肪(iBAT)及腹壁皮下脂肪(sWAT),进行H&E染色,并采用免疫组织化学染色法(IHC)检测大鼠iBAT和sWAT中解偶联蛋白-1(UCP1)的表达水平;RT-PCR法检测iBAT和sWAT中棕色基因的mRNA表达水平:UCP1、细胞死亡诱导DFFA样效应因子a(Cidea)、包含16的结构域(PRDM16)、转膜蛋白(Tmem26)、PPARG共激活因子1α(PGC1α)、过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)、分化簇137(CD137);蛋白质免疫印迹法(WB)检测iBAT和sWAT中磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化激素敏感性甘油三酯脂肪酶(p-HSL)、UCP1、线粒体呼吸链复合物Ⅲ(Complex Ⅲ)及线粒体呼吸链复合物V(Complex V)的蛋白表达水平。结果:1 和正常体重人群相比,肥胖人群sWAT中UCP1、Cidea、Tmem26、PGC1 α及PPARγ的mRNA水平显著下降,且UCP1的mRNA水平与肥胖人群的BMI、HOMR-IR呈线性负相关。2 和正常体重人群相比,肥胖人群vWAT中UCP1、Cidea、Tmem26、PGC1 α及PPARγ的mRNA水平显著下降,且UCP1的mRNA水平与肥胖人群的BMI、HOMR-IR呈线性负相关。3 和正常饮食组大鼠相比,SD大鼠高脂喂养18周后,出现明显体重增加和胰岛素抵抗。4 高脂饮食组大鼠对寒冷的耐受能力较正常组下降。5 高脂饮食组大鼠棕色脂肪细胞体积增大、iBAT内胰岛素敏感性及脂解能力降低、iBAT中UCP1及其他棕色基因的表达水平下降,更趋“白色化”。6 高脂饮食组大鼠皮下脂肪细胞体积增大、sWAT内胰岛素敏感性及脂解能力降低、sWAT中UCP1及其他棕色基因的表达水平下降,sWAT“棕色化”水平降低。结论:1 肥胖人群中sWAT和vWAT中“棕色化”水平均下降,且这两种脂肪组织中UCP1的表达水平与BMI、HOMR-IR呈线性负相关。2 高脂饮食诱导大鼠出现系统及脂肪组织局部胰岛素抵抗,大鼠产热能力下降;同时,iBAT和sWAT的脂解能力下降,棕色化水平降低。目的:本部分用黄秋葵和二甲双胍干预高脂饮食喂养大鼠,观察黄秋葵及二甲双胍对高脂喂养大鼠一般代谢状况、棕色脂肪活性和皮下脂肪“棕色化”水平是否有影响。方法:1 6周龄SD大鼠适应性喂养一周后,随机分为以下4组:(1)正常饮食组,给予普通饲料喂养18周,第11周起给予等量生理盐水灌胃,灌胃时间持续8周;(2)高脂饮食组,给予高脂饲料喂养18周,第11周起给予等量生理盐水灌胃,灌胃时间持续8周;(3)高脂饮食加黄秋葵组,给予高脂饲料喂养18周,第11周起给予800mg/kg/d黄秋葵灌胃,干预时间为8周;(4)高脂饮食加二甲双胍组,给予高脂饲料喂养18周,第11周起给予200mg/kg/d二甲双胍灌胃,干预时间为8周。2 每周记录大鼠体重,第18周末进行胰岛素抵抗相关指标检测:空腹血糖、空腹血胰岛素、HOMR-IR、IPGTT、IPITT,并进行冷刺激试验。3 对大鼠肩胛间棕色脂肪、腹壁皮下脂肪进行石蜡包埋并行H&E染色,采用免疫组织化学染色法检测UCP1的表达;实时荧光定量PCR法检测棕色脂肪、皮下脂肪内棕色基因(UCP1、Cidea、PRDM16、Tmem26、PGC1 α、PPARγ、CD137)及炎症因子的mRNA表达水平;WB法检测棕色脂肪及皮下脂肪内p-AKT、p-HSL、UCP1、ComplexⅢ、Complex Ⅴ的蛋白表达水平。结果:1 和高脂饮食组相比,黄秋葵和二甲双胍明显改善高脂饮食诱导的体重增加、脂肪堆积和系统胰岛素抵抗表型。2 高脂饮食组大鼠给予黄秋葵和二甲双胍干预后,其对寒冷的耐受能力增强。3 黄秋葵和二甲双胍可改善高脂饮食诱导的棕色脂肪细胞体积增大、增加棕色脂肪中胰岛素敏感性和脂解能力、上调棕色脂肪内棕色基因的表达、降低炎症水平。4 黄秋葵和二甲双胍可改善高脂诱导的皮下脂肪细胞体积增大、增加皮下脂肪组织内的胰岛素敏感性和脂解能力、上调皮下脂肪中棕色基因的表达、改善高脂饮食诱导的皮下脂肪组织内炎症反应。结论:1.黄秋葵和二甲双胍可改善高脂饮食诱导的大鼠代谢紊乱。2.黄秋葵和二甲双胍可改善高脂饮食诱导的棕色脂肪活性下降,增加棕色脂肪组织内UCP1等棕色基因的表达、增加产热,降低高脂诱导的棕色脂肪中炎症反应。3.黄秋葵和二甲双胍可改善高脂饮食诱导的皮下脂肪“棕色化”水平降低,增加皮下脂肪中棕色基因的表达、降低炎症水平。目的:分别通过动物和细胞实验探究黄秋葵和二甲双胍增加大鼠棕色脂肪活性并促进皮下脂肪”棕色化“的具体分子机制。方法:1.体外分离并培养大鼠棕色脂肪细胞、大鼠白色脂肪细胞、人白色脂肪来源的原代间充质干细胞(SVF),开始诱导细胞分化时加入黄秋葵和二甲双胍刺激,待细胞分化为成熟的脂肪细胞后,采用WB和RT-PCR方法检测细胞中棕色基因的mRNA水平和蛋白水平,同时检测柠檬酸合酶活性。2.在第2部分所建动物模型基础上,采用WB方法检测大鼠棕色脂肪和腹壁皮下脂肪组织中p-AMPK水平;此外,WB方法检测黄秋葵和二甲双胍刺激的分化成熟的大鼠原代棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞内p-AMPK水平。3.分化时在大鼠原代SVF细胞中加入AMPK抑制剂Compound C,再分别给予黄秋葵和二甲双胍刺激,待细胞分化为成熟的脂肪细胞后,RT-PCR方法检测细胞中棕色基因的mRNA水平,WB方法检测细胞中UCP1、Complex Ⅲ和Complex V的蛋白水平。4.分化时在大鼠原代SVF细胞中加入AMPK激动剂AICAR,再分别给予黄秋葵和二甲双胍刺激,待细胞分化为成熟的脂肪细胞后,RT-PCR方法检测细胞中棕色基因的mRNA水平,WB方法检测细胞中UCP1、Complex Ⅲ和Complex V的蛋白水平。结果:1.黄秋葵和二甲双胍分别刺激大鼠棕色脂肪、大鼠白色脂肪及人皮下脂肪来源的原代脂肪细胞后,细胞内棕色基因的mRNA水平增加,UCP1、Complex Ⅲ和Complex V的蛋白水平也明显增加;同时,大鼠原代棕色脂肪和白色脂肪细胞中柠檬酸合酶活性在黄秋葵和二甲双胍干预组也增强。2.高脂饮食大鼠iBAT和sWAT中p-AMPK水平下降,给予黄秋葵和二甲双胍干预后,p-AMPK水平增加。体外培养的大鼠原代棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞在黄秋葵和二甲双胍的刺激下,p-AMPK水平上调。3.给体外培养的大鼠原代棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞加入AMPK抑制剂一Compound C后,黄秋葵和二甲双胍干预组棕色基因的表达水平未见明显升高,UCP1、ComplexⅢ和Complex V的蛋白水平也无明显增加。4.给体外培养的大鼠原代棕色脂肪细胞和大鼠白色脂肪细胞加入AMPK激动剂一AICAR后,黄秋葵和二甲双胍刺激上调棕色基因表达水平的效果明显增加,UCP1、Complex Ⅲ和Complex V的蛋白水平也较相应的对照组升高。结论:1.黄秋葵和二甲双胍在体外亦可增加棕色脂肪及白色脂肪细胞中棕色基因的表达水平和线粒体功能,在体外进一步证明黄秋葵和二甲双胍可增加棕色脂肪活性,并促进白色脂肪“棕色化”的作用。2.黄秋葵和二甲双胍促进棕色脂肪活性及皮下脂肪“棕色化”的作用是通过激活AMPK而实现的。