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目的1探讨共培养条件下转染miRNA-101的骨髓间充质干细胞对大鼠肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophages of rats,AMs)的内质网应激是否具有保护作用。2通过检测AM内ERS相关标志物的变化,探讨转染miRNA-101的BMSCs发挥作用的可能机制。方法实验分组及模型制备:选取4周龄左右的SPF级雄性SD大鼠全骨髓贴壁法体外培养SD大鼠BMSCs至第三代。使用CD90、CD106、CD45抗体经流式细胞术对BMSCs进行鉴定,构建稳转miRNA-101的BMSCs,CCK-8检测BMSCs,转染miRNA-101的BMSCs,转染空质粒的BMSCs的细胞活性;与经过Si O2刺激的大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞构建transwell共培养体系,上室培养NR8383细胞,下室培养BMSCs,中间隔有通透性的聚碳酸酯膜,孔径为0.4μm;实验分为5组。对照组:NR8383细胞完全培养;模型组:NR8383+Si O2(50μg/ml);BMSCs干预组BMSCs+(NR8383+Si O2)共培养组;miRNA-101组:过表达miRNA-101的BMSCs+(NR8383+Si O2)共培养组;IRE1α抑制剂组:过表达miRNA-101的BMSCs与NR8383+Si O2+STF083010(40μmol/L)共培养组。培养6h、12h、24h、48h时留取NR8383细胞,应用倒置相差显微镜观察BMSCs和NR8383细胞的细胞形态;HE染色和CCK-8试剂盒观察巨噬细胞形态学改变及增殖情况;免疫印迹法检测IRE1α、TRAF2、JNK、LC3、Beclin-1的定量表达;免疫荧光法检测IRE1α、LC3在巨噬细胞中定位。所得数据用SPSS22.0软件进行分析,数据以xˉ±s表示,计量资料应用方差分析,两两比较用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1形态学观察:贴壁后BMSCs细胞体积小,呈圆形或三角形,平行分散式生长,传至第三代后,显微镜观察其形态单一,成梭形,细胞质丰富,细胞核清晰。2 NR8383显微镜下可见细胞形状为卵圆形或扁圆形,偶尔能见到不规则细胞,部分悬浮细胞体积较小。3流式细胞仪检测BMSCs表面抗原标志物阳性细胞占比CD106占94.45%,CD90占99.26%,CD45占17.50%,数据提示符合BMSCs特性。4 BMSCs病毒转染效率结果:当MOI=5pfu/细胞时转染效率最佳,此时细胞生长状态良好,呈蜂窝样,说明该转染滴度转染效率较高且不会对细胞生长造成影响。在荧光显微镜下定时进行观察于72h转染达到高峰。5 CCK-8检测BMSCs与转染空质粒的BMSCs细胞活性没有明显差距,无统计学意义(P>0.05),相较于以上两组,转染miRNA-101的BMSCs活性明显增强(P<0.05)。6 HE染色结果:对照组NR8383细胞呈圆形,胞核居中或偏位,胞质颜色均匀,细胞结构清晰。模型组相对于对照组细胞体积增大,胞核偏移,胞质破裂呈不规则毛刺样改变。各干预组较模型组被激惹程度明显降低但仍高于对照组,其中miRNA-101组细胞形态优于BMSCs干预组,IRE1抑制剂组细胞被激惹程度仅低于模型组而高于其他各组。7 CCK-8细胞增殖检测结果:随着培养时间延长,对照组在3-6小时开始增殖,于24小时增殖速度达到顶峰随后速度放缓进入平台期;其他各组细胞增殖趋势与对照组相同,BMSCs干预组和miRNA-101干预组明显优于模型组(P<0.05),IRE1抑制剂组与模型组没有统计学意义,各干预组之间差异不明显,但整体仍低于对照组(P<0.05)。8 Western blot检测结果:对照组LC3、Beclin-1、IRE1、TRAF2及JNK蛋白均未产生明显变化,各时间点仅有基础表达量,模型组各蛋白表达量在6h后开始升高,于24h达到顶峰,在各个时间点均高于同期对照组(P<0.05)。相对于模型组,BMSCs干预组,miRNA-101干预组的各蛋白在各时间点表达显著下降(P<0.05),其中,miRNA-101干预组优于BMSCs干预组(P<0.05)。IRE1抑制剂组中IRE1、TRAF2、JNK蛋白表达量呈低表达,LC3、Beclin-1蛋白表达量仅低于模型组而高于其他各组。9 IRE1、LC3在4个时间点的对照组仅有基础表达,相比同期,模型组的荧光表达量明显增强,BMSCs干预组、miRNA-101干预组和IRE1抑制剂组,与模型组相比,荧光表达量降低,随时间推移呈动态变化。结论过表达miRNA-101的BMSCs通过调控NR8383细胞ERS能有效抑制自噬,对巨噬细胞产生一定保护作用,且效果优于单纯BMSCs治疗。图21幅;表7个;参117篇。