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研究目的1.研究抑癌基因WTX在新鲜结肠癌、癌旁组织及正常组织中的表达水平及定位。分析比较WTX基因表达水平与结肠癌临床病理特征之间的关系,以研究WTX基因表达异常与结肠癌之间的关联性。2.研究WTX在新鲜结肠癌、癌旁组织、正常组织及结肠癌Lovo细胞株中的甲基化水平。3.构建WTX慢病毒载体,体外转染结肠癌Lovo细胞株。检测WTX在转录及蛋白的表达水平及对细胞增殖、凋亡的影响。方法1.对接受根治性手术,并经病理检测证实的50例结肠癌患者的新鲜癌组织、癌旁组织和正常组织标本进行取材,分为癌组织组(C组)、癌旁组织组(CB组)和正常组织组(N组)。提取组织RNA, qPCR检测不同组织中WTX基因转录水平的表达。提取组织总蛋白,Western blot检测不同组织中WTX基因蛋白水平的表达。免疫组织化学法检测WTX在不同组中的表达定位情况并进行免疫组化评分(IHCS)。将C组的WTX表达水平与其临床病理特征进行分析比较。2.提取样本组织及结肠癌Lovo细胞株DNA,亚硫酸氢钠对DNA进行修饰,Wizard纯化树脂对DNA进行纯化。设计4条MSP特异性引物,甲基化特异性PCR (MSP)检测WTX在样本组织及结肠癌细胞中的甲基化水平。3.根据Invitrogen公司的Gateway技术构建携带WTX基因的慢病毒载体PLV.Ex3d.null-EF1A>WTX>IRES/eGFP,挑取阳性克隆质粒,送交阳性克隆测序。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒同时转染293FT细胞,离心获得病毒上清,计算慢病毒滴度。将结肠癌Lovo细胞株分为空白细胞组(Cell组)、空载体组和WTX转染组(WTX组)行病毒转导,48-72小时后荧光显微镜观察转导效率。qPCR及Western blot分别检测各组细胞WTX转录及蛋白表达；流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡水平；CCK8法检测细胞抑制率并绘制细胞生长曲线；流式细胞仪测定细胞周期。结果1.所有标本均有WTX表达。qPCR及Western blot法对标本进行WTX的mRNA及蛋白表达水平检测显示,C组WTX基因的平均表达水平低于N组和CB组,CB组WTX表达低于N组(p<0.05)。免疫组化结果显示WTX在N组、CB组及C组均主要为胞浆表达,在胞膜有少量表达。C组IHCS评分低于N组及CB组(p<0.05)。N组与CB组IHCS评分无明显差异。C组IHCS评分与患者性别(r=—0.168，p=0.245)、年龄(r=—0.170,p=0.238)、肿瘤部位(r=0.022,p=0.879)无关；而与肿瘤分化程度(r=0.711,p<0.01)呈正相关(即肿瘤分化程度越高,IHCS评分越高)；与肿瘤大小(r=—0.510,p<0.01)呈负相关(即肿瘤越大,IHCS评分越低)；与肿瘤血管浸润(r=—0.804,p<0.01)呈负相关(即有血管浸润的病例,IHCS评分越低)；与肿瘤神经浸润(r=—0.785,p<0.01)呈负相关(即有神经浸润的病例,IHCS评分越低)；与肿瘤的TNM分期(r=—0.948,p<0.01)呈负相关(即TNM分级越高,IHCS评分越低)。2.组织MSP检测显示WTX基因在C组中的甲基化阳性率高于CB组和N组(p<0.05)；在Lovo细胞中MSP检测未发现WTX基因甲基化。3.成功通过Gateway技术构建携带WTX基因的慢病毒载体PLV.Ex3d.null-EF1A>WTX>IRES/eGFP,鉴定正确；慢病毒包装成功,滴度符合实验要求；病毒转导Lovo细胞48-72小时后荧光显微镜下观察慢病毒载体组(WTX组)及空载体组荧光均较弱,通过挑克隆培养法建成稳定表达WTX的Lovo细胞系Lovo/WTX-eGFP。采用WTX质粒及空载对照质粒进行瞬时转染,48-72小时后WTX组观察荧光转染效率约35%,空载体组约70%。qPCR及Western blot检测均提示转染后WTX表达水平增高；流式细胞仪检测WTX过表达对Lovo细胞凋亡水平无明显影响；CCK8法检测：96孔板转染镜下可见转染后随时间增长,WTX组细胞数较Cell组及空载体组减少,荧光逐渐增强,但WTX组荧光仍少于空载体组。WTX过表达明显抑制Lovo细胞增殖水平。细胞周期检测发现转染WTX后Lovo细胞被阻滞在G0/G1期。结论1.抑癌基因WTX结肠癌中表达降低与结肠癌的恶性程度及周围组织浸润密切相关,WTX表达缺失可能是结肠癌发生的重要原因之一。2.WTX在C组中甲基化阳性率高于CB组和N组,而在结肠癌Lovo细胞株中WTX甲基化呈阴性,尚需对其它结肠癌细胞株进行MSP检测以明确甲基化是否是导致WTX在结肠癌组织中表达降低的原因。3.WTX慢病毒载体构建成功,但细胞转导效率低,与WTX基因CDS区较长,影响绿色荧光蛋白eGFP表达有关。成功建立表达WTX的Lovo细胞系Lovo/WTX-eGFP。WTX质粒瞬时转染后WTX转录及蛋白水平表达明显升高。WTX转染后Lovo细胞增殖受到明显抑制,对细胞凋亡无明显影响。