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药疹为药物超敏反应的特殊类型之一,又称为皮肤药物不良反应(cutaneousadverse drug reactions,cADRs),临床上主要分为大疱型药疹和非大疱型药疹两类。非大疱型药疹症状轻微,多在撤药后1-2周内逐渐消退。大疱型药疹包括Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson syndrome,SJS)及中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis,TEN),一般发生率约为1/1000～1/10000,90％以上的严重皮肤反应发生在用药后2个月,致死率高达30%。
药物是诱发药疹的基础,但其发病机制尚未定论,遗传基因多态性可能是一个重要的影响因素。人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)基因是调控人体免疫应答特异性及影响个体疾病易感性差异的多态性系统。许多研究结果表明,抗癫痫类药物、磺胺类抗菌药、苯并噻嗪类抗炎药等诱发的药疹与HLA基因存在一定的相关性.
研究报道台湾汉族人群服用卡马西平(CBZ)出现SJS/TEN与HLA-B*1502等位基因显著相关。但服用卡马西平耐受的患者中同样检测到HLA-B*1502基因,因此只检测HLA-B*1502基因作为预防SJS/TEN的发生存在一定的假阳性率。日本学者报道SJS/TEN患者的眼部并发症与HLA-A*0206等位基因相关。也有研究报道抗癫痫药物诱发的药疹与HLA-A*3101、HLA-B*5901、HLA-Cw*0704等基因相关。最新研究认为HLA-B*1502基因阳性患者中TCRVβ11发生谱型漂移时易诱发SJS/TEN。
本研究将通过收集临床药疹病例,分析药疹患者的临床特征以及影响因素。采用PCR-SSP方法检测HLA基因8个位点,探讨药疹的发生与HLA基因多态性的关系。采用RT-PCR及免疫扫描谱型分析法检测HLA-B*1502基因阳性者中mRNA表达及TCR Vβ11谱型,进一步探讨抗癫痫药物诱发大疱型药疹的发病机制。
研究目的
分析临床药疹病例的基本临床特征及影响因素,探讨河南地区药物诱发的药疹与HLA基因8个位点的相关性,并进一步研究抗癫痫药物诱发的SJS/TEN与HLA-B*1502 mRNA表达水平及TCR Vβ11谱型的相关性。
研究方法
1.研究对象
共收集药疹病例278例,进行临床资料分析。选取其中48例药疹患者检测HLA-B*1502等基因多态性,另各选60例作为耐受组和对照组。进一步测定HLA-B*1502基因阳性患者中4例抗癫痫药物所诱发的SJS/TEN患者、6例耐受患者和6例正常对照的mRNA表达及TCR-Vβ11谱型。
2.药物诱发药疹与HLA-B*1502等基因的相关性
采用PCR-SSP方法检测HLA-B*1502、HLA-A*0206、HLA-A*3101、HLA-A-1101、HLA-B*5901、HLA-Cw*0704、HLA-Cw*0801、HLA-DRB1*11202等8个基因位点,分析药疹与HLA各等位基因的相关性。
3.抗癫痫药物诱发SJS/TEN与HLA-B*1502tuRNA表达水平的相关性采用相对荧光定量PCR检测HLA-B*1502 mRNA的表达水平,通过2-△△Ct法进行HLA-B*1502 mRNA表达水平的相对定量。
4.抗癫痫药物诱发SJS/TEN与TCR Vβ11谱型的相关性采用免疫扫描谱型分析方法对标记的PCR产物进行扫描,并通过PeakScanner软件对数据进行分析。
研究结果
1.临床药疹病例分析
通过对278例临床药疹病例的分析结果显示,药物诱发的药疹与患者的年龄、性别、用药潜伏期无关,重症药疹的致死率明显高于轻症药疹组。致敏药物占前三位的是抗生素类药物(35.25%)、抗癫痫类药物(26.62%)、非甾体解热镇痛药(NSAIDS)(25.18%).大疱型药疹组致敏药物中所占比例最高的是抗癫痫类药物,达35.82%。
2.药物诱发药疹与HLA-B*1502等基因的相关性
药物诱发的药疹可能与HLA-B*1502、HLA-Cw*0801、HLA-A*0206和HLA-Cw*0704等位基因相关(P＜0.05)。
2.1药疹类型
药物诱发的大疱型药疹与HLA-B*1502等位基因相关(P＜0.01),而非大疱型药疹与HLA-A*0206、HLA-Cw*0704等位基因相关(P均均＜0.01)。
2.2药物类型
抗癫痫药物诱发的药疹与HLA-B*1502、HLA-Cw*0801、HLA-A*0206、HLA-Cw*0704和HLA-A*3101等位基因相关(P均＜0.05),其中大疱型药疹与HLA-B*1502等位基因的相关性最强(P＜0.01),OR值达36;NSAIDS类药物诱发的大疱型药疹可能与HLA-A*0206等位基因相关(P＜0.05);抗生素类药物诱发的药疹可能与HLA-B*1502、HLA-A*0206、HLA-Cw*0704等位基因相关(P均＜0.05);中药/中成药类药物诱发的药疹可能与HLA-A*0206等位基因相关(P＜0.05)。
3.抗癫痫药物诱发的SJS/TEN与HLA-B*1502mRNA水平的相关性
3.1 HLA-B*1502等位基因测序验证
将测序结果输入NCBI的Blast工具进行序列比对,排除特异性引物包括2个多态位点,测序的结果包括6个多态位点,测序结果准确无误。
3.2 RT-PCR特异性扩增HLA-B*1502基因
RT-PCR结果显示,所有的cDNA标本均扩增出HLA-B*1502基因及内参基因的目的片段,条带均单一且大小正确。
3.3 HLA-B*1502 mRNA相对荧光定量
与对照组相比,大疱型药疹组和耐受组2-△△Ct均值分别为为12.11±0.19,1.12±0.11;与耐受组相比,大疱型药疹组2-△△Ct均值为10.86±1.12。通过统计分析,大疱型药疹组HLA-B*1502 mRNA的表达水平显著高于耐受组及对照组(P均＜0.01)。
4.抗癫痫药物诱发的SJS/TEN与TCR Vβ11谱型的相关性
PeakScarmer v1.0软件对基因扫描图的自动分析显示,4例HLA-B*1502基因阳性的SJS/TEN患者TCR vβ11的谱型均出现单克隆峰,而HLA-B*1502基因阳性的耐受者及正常对照者TCR vβ11谱型均为正常的高斯分布。
结论
1.抗癫痫药物诱发的大疱型药疹与HLA-B*1502等位基因的相关性最强;NSAIDS类药物诱发的大疱型药疹可能与HLA-A*0206等位基因相关;抗生素类药物诱发的药疹可能与HLA-B*1502、HLA-A*0206、HLA-Cw*0704等位基因相关;中药/中成药类药物诱发的药疹可能与HLA-A*0206等位基因相关;
2.检测HLA-B*1502mRNA表达水平和TCR Vβ11亚型的谱系漂移可以作为预测抗癫痫药物诱发大疱型药疹的重要指标。