论文部分内容阅读
研究目的：研究炎性Treg细胞(IL-17+Foxp3+Treg细胞)在胆道闭锁(Biliary Atresia, BA)肝内胆管组织中的表达情况,观察Foxp3基因启动子区的DNA甲基化对IL-17+Foxp3+Treg细胞分化的影响。初步阐明Foxp3基因甲基化对Treg细胞亚群分化及其在BA发病中的作用。研究方法：确诊为胆道闭锁患儿32例,在行Kasai手术中取肝脏组织,对照组30例,部分肝脏组织行匀浆取上清进行ELISA检测IL-6.IL-17、IL-1β、IL-12p40、TGF-β、 IL-23、IL-10等细胞因子含量：RT-qPCR、Western Blot检测Foxp3和ROR-yt基因的表达情况；部分组织行免疫荧光化学染色观察IL-17+Foxp31Treg细胞分布；部分肝脏组织行流式细胞术检测,观察IL-17-Foxp3+Treg细胞、IL-17+Foxp3+Treg细胞及IL-17+ Th17细胞的比例,并通过流式分选这三种细胞,分别通过亚硫酸氢钠处理后测序法(BSP)检测IL-17+Th17细胞、IL-17+Foxp3+Treg细胞中Foxp3基因启动子区CpG岛甲基化状态：同时,留取部分IL-17+Foxp3+Treg细胞进行增殖培养,检测细胞上清液中相关细胞因子含量。通过轮状病毒(Rotavirus,RRV)建立胆道闭锁动物模型,新生的BALB/c小鼠随机分为3组：①RRV组：新生鼠在出生后12小时内腹腔注射RRV：②对照组：新生鼠在出生后12小时内腹腔注射培养基；③甲基化干预组(Aza组)：新生鼠在出生后12小时内腹腔注射RRV,并在出生后每天腹腔注射甲基化抑制剂Aza.分别取注射病毒后第4天、第7天、第11天的小鼠肝脏组织,ELISA检测IL-6、IL-17、IL-1β、IL-12p40、TGF-β、IL-23等细胞因子含量；RT-qPCR、Western Blot检测Foxp3和ROR-yt基因的表达情况;免疫荧光化学染色观察IL-17+Foxp3+Treg细胞分布；流式细胞术检测,观察IL-17-Foxp3+Treg细胞、IL-17+Foxp3+Treg细胞及IL-17Th17细胞的比例,并通过流式分选这三种细胞,BSP法检测IL-17+Foxp3+Treg细胞、IL-17+Foxp3+Treg细胞中Foxp3基因启动子区CpG岛甲基化状态。为了探究局部炎性环境对IL-17+Foxp3+Treg细胞分化的影响,提取小鼠肝脏CD4+ naive T细胞,分别在以下三种细胞培养体系中进行培养：①TGF-β, anti-IFN-γ, anti-IL-4;②TGF-β, anti-IFN-γ, anti-IL-4, Aza; ③TGF-β, IL-6, anti-IFN-γ, anti-IL-4。在不同培养环境中连续培养7天,ELISA检测各培养体系中IL-10、IL-17等细胞因子的含量,同时收集细胞,检测细胞中IL-17-Foxp3+Treg细胞、IL-17+Foxp3+Treg细胞及IL-17+Thl7细胞的比例变化,检测三种体系中Foxp3基因启动子区CpG岛甲基化状态。实验结果：在BA患儿和动物模型肝脏组织中,与对照组比较,BA组肝脏组织汇管区周围IL-17+Foxp3+Treg细胞逐渐升高,第7天达到高峰。此时,BA组小鼠的黄疸率(85.3±12.36%)和陶土色大便发生率(80.6±15.22%)达到最高,BA小鼠开始逐渐死亡,14天的生存率仅为20.5±3.24%。ELISA检测发现BA组IL-12p40(Thl相关因子)、IL-23、IL-17(Th17相关因子)、IL-10、TGF-β1(Treg细胞相关因子)IL-6、IL-1β较对照组均显著升高,且促炎细胞因子(IL-12p40、IL-23、 IL-17、IL-6、IL-1β)较抑炎细胞因子(IL-10、TGF-β)含量更高。通过将患儿肝脏中IL-17+Foxp3+Treg细胞进行体外增殖培养,我们发现与对照组相比,细胞上清中IL-17细胞因子含量显著性增高(32.45±12.375pg/ml vs 3.84±1.352pg/ml),说明在BA肝脏中,IL-17+Foxp3+Treg细胞具有显著的促炎作用。甲基化检测显示与对照组比较,BA组肝脏组织中Foxp3启动子CpG岛甲基化显著上升(人：73.2±16.17% vs. 2.9±0.85%;小鼠：70.3±10.51% vs.13.5±4.67%,p<0.01)。通过动物干预实验,我们发现甲基化干预后的小鼠与RRV组相比,黄疸率(60.3±12.34%)和陶土色大便发生率(57.5±11.25%)较BA组均有显著下降,而且,出现死亡小鼠的时间(8.3±0.58天)延后、感染后14天的总体生存率(59.3±9.52%)有明显上升。肝脏组织汇管区周围IL-17+Foxp3+Treg细胞浸润减少,细胞比例下降,同时也伴随着炎症细胞因子含量的明显下降。Foxp3基因甲基化水平(25.3±9.63%)下降,Foxp3表达增强,基因和蛋白水平也相应地明显上升。体外细胞诱导实验中,经过7天的培养,在培养环境①中,Foxp3基因表达明显增强,IL-17-Foxp3+Treg细胞比例最高,达到76.4±14.2%, IL-17+Foxp3+Treg细胞比例为3.7±0.49%, Foxp3基因甲基化率约为9.4±3.7%；在Aza干预下,培养基中IL-10、TGFβ1浓度有明显升高,IL-17-Foxp3+Treg比例上升,达到85.6±18.49%, Foxp3甲基化率下降至6.2±2.45%；在培养环境③中,Foxp3基因表达明显减弱,IL-17+Foxp3+Treg细胞比例为11.6±3.79%,而IL-17- Foxp3+Treg细胞比例最低,约为1.45±0.28%, IL-17+Th17细胞比例最高,约为58.2±10.2%,。实验结论：1.在胆道闭锁患儿肝脏组织汇管区周围,IL-17+Foxp3+Treg细胞比例较对照组明显增高；在动物实验肝脏组织中,IL-17+Foxp3+Treg细胞比例逐渐升高,在第7天达到峰值,之后比例逐渐下降。表明IL-17+Foxp3+Trreg细胞在BA肝脏中存在并参与了胆管免疫炎性反应。2.体外培养IL-17+Foxp3+Treg细胞,上清中能够检测到明显IL-17细胞因子,说明IL-17+Foxp3+Treg细胞具有促炎作用。3.BA肝脏组织中IL-17+Foxp3+Treg的增殖分化受到Foxp3基因启动子区CpG岛甲基化的调节,当Foxp3甲基化升高时,基因表达减低,细胞向IL-17+Foxp3+ Treg细胞分化加强；当Foxp3甲基化下降时,基因表达升高,细胞向IL-17-Foxp3+ Treg细胞分化增加。4. IL-17+Foxp3+Treg细胞参与了胆道闭锁胆管炎症。抑制Foxp3基因甲基化可以减少肝脏汇管naive细胞向IL-17+Foxp3+Treg细胞分化,减轻BA小鼠肝脏内的炎症反应,降低小鼠的黄疸率,延长生存率,可能成为将来胆道闭锁免疫治疗的新方向。