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目的:(1)分析牛蒡皮的主要成分;(2)研究提取牛蒡皮绿原酸的最佳工艺条件,得到牛蒡皮绿原酸提取物;(3)优化牛蒡皮绿原酸提取物分离纯化的方法条件,制备出纯度较高的牛蒡皮绿原酸;(4)了解牛蒡皮绿原酸提取物能否改善试验大鼠的脂代谢紊乱状态;了解牛蒡皮绿原酸提取物能否改善试验大鼠的氧化应激状态;(5)通过对高脂血症大鼠代谢组学的研究,探索能够表征高脂血症发生、发展和恢复状态的生物标记物。
方法:(1)采用传统植物化学物定性鉴定方法确定牛蒡皮中可能含有以及不含的植物化学物。(2)选用酸水提取法提取牛蒡皮绿原酸,在单因素试验的基础上,设计L9(34)正交优化试验,以提取率最高的条件来提取制备牛蒡皮绿原酸。(3)通过预试验以及吸附特性,选取D101大孔吸附树脂对牛蒡皮绿原酸提取物进行分离纯化,探索较好的分离纯化条件,得到纯度较高的牛蒡皮绿原酸。(4)试验大鼠分为阴性对照组、高脂模型组、牛蒡皮绿原酸提取物低剂量组和牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组4个组,除阴性对照组外其余各组均饲以高脂饲料,受试物各组分别给予受试物牛蒡皮绿原酸提取物60、120mg/bw.kg.d灌胃。连续喂养4周,测定各组大鼠体重、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。(5)以超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)为核心技术,以主成分分析法(principal component analysis,PCA)为数据分析手段,研究阴性对照组、高脂模型组和牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组大鼠血浆中代谢物组的变化和对应关系,找出其中可能的生物标记物。
结果:(1)通过定性实验证实,牛蒡皮中可能含有生物碱、黄酮类化合物、三萜类化合物以及酚类物质,不含糖、甙以及醌类物质。(2)单因素试验结果表明:最佳提取工艺参数为盐酸浓度1%,料液比1:80,提取时间70min,提取温度80℃,碎度24-40目,提取3次。正交试验结果表明,影响绿原酸酸水提取的主要因素为破碎度(B),其次为液料比(C)、提取次数(D)以及溶剂浓度(A)。最佳提取工艺条件为B3C3D3A2,即破碎度20-40目,料液比1:80,以0.5%盐酸水溶液提取3次,每次70min,绿原酸的得率约为0.521%。此条件即为提取牛蒡皮绿原酸的最佳条件。(3)D101大孔吸附树脂可以有效地分离、纯化出粗提物中的绿原酸。在20cm×2.5cm的层析柱上样200ml,以蒸馏水冲洗,并以40%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为11.65%的绿原酸。(4)动物实验结果表明,与高脂模型组相比,牛蒡皮绿原酸提取物能降低高脂大鼠TG、TC水平,升高血浆HDL-c这一保护性因子水平,并且能够提高SOD、GSH-Px活性,降低MDA水平,效果以牛蒡皮绿原酸高剂量组最为明显,而且从结果来看,其降脂以及抗氧化的效果均较好。(5)对血浆中小分子成分的鉴别比较表明,牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组、阴性对照组以及高脂模型组间存在差异。
结论:(1)酸水提取法,虽然不是新型的提取方法,但与常规水提法相比,具有高效的优点;与醇提法相比,提取效果相差不大,但可以避免大量有机溶剂的使用,可以减少有机污染,有广阔的发展前景。试验证实其适合提取牛蒡皮中的绿原酸,最佳提取工艺条件为:破碎度20-40目,料液比1:80,以0.5%盐酸水溶液提取3次,每次70min,绿原酸的得率约为0.521%。(2)D101大孔吸附树脂可以有效地分离纯化粗提物中的绿原酸,最佳条件为:在20cm×2.5cm的层析柱上样200ml,以蒸馏水冲洗,并以40%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为11.65%的绿原酸。D101大孔吸附树脂可以较好地分离纯化牛蒡皮粗提物中的绿原酸,该树脂的吸附特性适合分离牛蒡皮中的绿原酸,可得到较高纯度的牛蒡皮绿原酸,为进一步的功能试验奠定了基础。(3)牛蒡皮绿原酸提取物对大鼠高脂状态具有良好的调节作用,同时对高脂大鼠的氧化应激状态具有良好的调节作用,具体机制有待进一步的研究。(4)发现牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组、阴性对照组以及高脂模型组血浆中的小分子成分存在差异,但是具体物质的鉴定工作尚需进一步的试验。