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研究目的1.实验部分通过建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,在细胞水平上模拟心肌缺血再灌注损伤过程,观察龙牙楤木总皂苷对心肌细胞H/R损伤的影响,并研究其作用机制是否与PI3K/Akt/GSK3β信号转导通路以及线粒体ATP敏感性钾通道有关。2.临床部分采用真实世界研究方法,观察养心氏片治疗冠心病稳定型心绞痛的有效性及安全性,并分析影响其临床疗效的可能因素。研究方法1.实验部分实验一:H9c2心肌细胞培养及模型时间、药物浓度探索。设置不同的缺氧/复氧时间,CCK-8法检测细胞存活率从而确定最适缺氧/复氧损伤时间,在此基础上探索龙牙楤木总皂苷保护心肌细胞H/R损伤的药物浓度;实验二:龙牙楤木总皂苷对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用初探。将H9c2心肌细胞随机分为正常组、模型组、龙牙楤木总皂苷组,建立缺氧/复氧损伤模型,按分组设置给予药物预处理,CCK-8法检测细胞存活率、Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率、微板法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、细胞丙二醛（MDA）含量、WST-1法检测心肌细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力,荧光定量PCR法检测细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bax、Bcl-2的mRNA相对含量、蛋白质印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2、Caspase-9、细胞色素C（CytC）的表达;实验三:基于PI3K/Akt信号通路研究龙牙楤木总皂苷对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。将细胞随机分为正常组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、龙牙楤木总皂苷+LY294002组、LY294002组,建立细胞H/R损伤模型,CCK-8法检测细胞存活率、Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率、微板法测定培养液中LDH活力、细胞MDA含量、WST-1法检测细胞SOD活力、Western blot法检测各组细胞Caspase-3的表达以及PI3K/Akt/GSK3β信号通路相关蛋白Akt、GSK3β的磷酸化水平;实验四:基于线粒体ATP敏感性钾通道研究龙牙楤木总皂苷对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。将细胞随机分为正常组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、5-羟基癸酸组、龙牙楤木总皂苷+5-羟基癸酸组、二氮嗪组,建立细胞H/R损伤模型,CCK-8法检测各组心肌细胞存活率、Western blot法检测Caspase-3表达,分离并提取各组心肌细胞线粒体、胞浆蛋白,Western blot法分别检测心肌细胞线粒体、胞浆中的CytC表达。2.临床部分收集使用养心氏片的冠心病稳定型心绞痛患者的性别、年龄、病程等信息,通过随访观察样本人群用药后的中医证候总积分、心绞痛发作情况、西雅图心绞痛量表积分及生命体征变化情况,观察养心氏片治疗稳定型心绞痛的有效性及安全性,并采用logistic回归的方法分析影响养心氏片疗效的多种因素。研究结果1.实验部分实验一:选取缺氧12h/复氧2h作为本次实验H9c2心肌细胞的缺氧/复氧模型时间,选取0.1mg/L作为本次实验的龙牙楤木总皂苷药物浓度;实验二:CCK-8结果显示,与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组心肌细胞经As预处理,H/R损伤后细胞存活率明显提高（P＜0.01）;Annexin V-FITC/PI结果显示,与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组细胞凋亡率明显下降（P＜0.01）;微板法及WST-1法检测结果显示,与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组细胞培养液中LDH活力明显下降（P＜0.01）,细胞MDA含量降低（P＜0.05）,SOD活力升高（P＜0.05）;qPCR结果显示,与正常组相比,H/R组心肌细胞Caspase-3mRNA相对含量明显增加（P＜0.01）、促凋亡相关因子BaxmRNA相对含量明显增加（P＜0.01）、抗凋亡因子Bcl-2mRNA相对含量明显减少（P＜0.01）,而与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组心肌细胞Caspase-3mRNA相对含量降低（P＜0.05）、BaxmRNA相对含量降低,但差异无统计学意义（P＞0.05）、抗凋亡相关因子Bcl-2mRNA含量明显升高（P＜0.01）;Western blot结果显示,给予H/R损伤后,与Control组相比,H/R组心肌细胞凋亡相关蛋白包括Caspase-3、Bax、Caspase-9、CytC表达升高（P＜0.05）、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低（P＜0.05）,而与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组凋亡相关蛋白包括Caspase-3、Bax、Caspase-9、CytC表达降低（P＜0.05）、抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高（P＜0.05）;实验三:CCK-8结果显示,给予PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+LY294002组心肌细胞存活率明显降低（P＜0.01）;AnnexinV-FITC/PI法结果显示,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+LY294002组细胞凋亡率升高（P＜0.05）;微板法及WST-1法结果显示,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+LY294002组细胞培养液中LDH活力明显升高（P＜0.01）,MDA含量升高（P＜0.05）、SOD活力明显下降（P＜0.01）;Western blot结果显示,加入LY294002后,龙牙+LY294002组凋亡相关蛋白Caspase-3表达量较龙牙楤木总皂苷组明显升高（P＜0.01）;与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平上调（P＜0.05）,而加入LY294002后,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+LY294002组Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平明显下调（P＜0.01）;实验四:CCK-8结果显示,在给予线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-羟基癸酸（5-HD）及开放剂二氮嗪（DZ）处理后,与H/R组相比,5-HD组心肌细胞存活率降低但差异无统计学意义（P＞0.05）,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+5-HD组心肌细胞存活率明显降低（P＜0.01）,与H/R组相比,二氮嗪组细胞存活率明显升高（P＜0.01）;Western blot结果显示,与H/R组相比,5-HD组心肌细胞Caspase-3表达量升高（P＜0.05）,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+5-HD组细胞Caspase-3表达量明显升高（P＜0.01）,与H/R组相比,二氮嗪组细胞Caspase-3表达量明显下降（P＜0.01）;分离细胞线粒体与胞浆,Western blot分别检测线粒体及胞浆CytC表达量,结果显示,模型组线粒体内CytC相对表达量降低,胞浆内表达量升高,与Control组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）,与H/R组相比,龙牙楤木总皂苷组线粒体内CytC表达量升高,胞浆内表达量降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,表明H/R损伤后CytC由线粒体向胞浆释放增加,而给予As处理后,CytC由线粒体向胞浆内释放减少,给予mitoKATP阻断剂5-羟基癸酸后,与H/R组相比,5-HD组心肌细胞线粒体内CytC表达量降低,胞浆内表达量升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,给予mitoKATP开放剂二氮嗪后,与H/R组相比,DZ组细胞线粒体内CytC表达量升高,胞浆内表达量降低（P＜0.05）,说明mitoKATP的开闭与CytC由线粒体至胞浆的释放有关,与龙牙楤木总皂苷组相比,龙牙+5-HD组细胞线粒体内CytC表达量明显降低,胞浆内表达量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,说明在特异性的关闭该通道后,龙牙楤木总皂苷减少CytC从线粒体释放到胞浆的作用被部分抑制。2.临床部分研究结果显示,临床症状疗效方面,养心氏片对冠心病心绞痛患者的中医证候总积分均具有一定的改善作用,四次就诊患者中医证候总积分依次降低,即第四次＜第三次＜第二次＜第一次（P＜0.01）,同时,患者心绞痛发作疼痛评分及平均持续时间四次就诊均表现为逐渐好转,即第四次＜第三次＜第二次＜第一次（P＜0.01）,西雅图心绞痛量表五个维度包括患者躯体活动受限程度、心绞痛稳定状态、心绞痛发作情况、治疗满意程度和疾病认知程度评分四次就诊均表现为逐渐好转,即第四次＞第三次＞第二次＞第一次（P＜0.01）;安全性方面,本研究共发生2例不良事件,均为上呼吸道感染,不属于药物引起的不良反应,其严重程度较轻,不影响监测药物的使用,用药期间患者生命体征平稳;多因素统计分析结果显示,患者经养心氏片治疗后,影响中医证候总积分改善的因素有:病程、合并疾病、饮酒情况和总剂量。影响心绞痛发作时VAS评分改善的因素有:是否首次使用养心氏片、总剂量;影响心绞痛疼痛平均持续时间改善的因素有:性别、病程、总剂量。对西雅图心绞痛量表各维度疗效的多因素统计分析结果显示:性别、病程、总剂量、BMI、合并疾病情况会影响躯体活动受限程度的治疗效果;性别、病程、BMI、是否首次使用养心氏片是影响心绞痛稳定状态的主要因素;年龄、病程、BMI、合并疾病、总剂量是影响心绞痛发作情况的主要因素;性别、年龄、病程、饮酒情况、是否首次使用养心氏片、总剂量是影响治疗满意程度的主要因素;性别、病程、BMI、是否首次使用养心氏片是影响疾病认知程度的主要因素。研究结论1.龙牙楤木总皂苷对大鼠H9c2心肌细胞H/R损伤具有一定的保护作用,可减少H/R损伤引起的细胞凋亡、坏死以及氧化应激损伤,其作用机制可能与PI3K/Akt/GSK3β信号通路以及线粒体ATP敏感性钾离子通道部分相关。2.养心氏片治疗冠心病稳定型心绞痛安全有效,患者的年龄、性别、病程、处方剂量、合并疾病等因素可能影响养心氏片的临床疗效。