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目的:肝转移是导致结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）患者治疗失败及死亡的主要原因。转移靶器官免疫抑制微环境的建立与肿瘤成功转移密切相关。针对肝转移灶内免疫全景分析结果提示:以多形核嗜中性粒细胞（Polymorphonuclear Neutrophils,PMN）广泛浸润为主要病理特征的肝脏炎性微环境对转移性CRC细胞的定植与增殖起重要的支持作用,但其驱动因素和招募机制尚未阐明。本课题组前期利用高通量转录组测序技术筛选出促进CRC细胞远处转移的关键基因KIAA1199。关于KIAA1199促肿瘤的机制,既往研究主要围绕对肿瘤细胞自身侵袭转移能力的调控,而对远端靶器官局部微环境的调适重塑作用则不甚清楚。本研究旨在阐明肿瘤源性KIAA1199在CRC肝转移灶免疫抑制微环境形成过程中的作用及机制,为CRC肝转移的防治工作提供新的理论基础和治疗策略。方法:（1）收集CRC患者原发灶及肝转移灶组织标本,应用免疫组化及多重组织免疫荧光染色技术分析KIAA1199在原发灶及配对肝转移灶中的表达及免疫细胞组成比例差异;并结合癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）CRC数据进一步分析KIAA1199与肿瘤组织内免疫细胞浸润比例的相关性。（2）应用基因工程技术敲减或过表达小鼠MC38结肠癌细胞内的KIAA1199,并接种于C57BL/6小鼠中构建经脾肝转移模型及盲肠原位瘤自发肝转移模型,经大体及苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）直接观察肝脏转移灶形成情况。应用流式细胞术及多重组织免疫荧光术分析荷瘤鼠原发灶及肝转移灶内免疫细胞组成及功能状态。（3）分别使用anti-Ly6G、anti-CD8清除荷瘤小鼠体内PMN及CD8+T细胞,以进一步验证KIAA199依赖PMN抑制CD8+T细胞浸润及抗肿瘤活性,从而介导免疫逃逸。（4）分别采用梯度离心和免疫磁珠法分选人外周血及小鼠骨髓来源PMN,并通过transwell实验检测不同KIAA1199表达的CRC细胞培养上清诱导PMN迁移效率。（5）将PMN置于不同KIAA1199表达状态的CRC条件培养基（Conditioned medium,CM）中培养,12小时后提取总RNA进行高通量转录组测序比较各组间PMN表型差异,并进一步通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证表型相关分子表达情况。将CM驯化后的PMN与CD8+T细胞共培养,72小时后检测T细胞增殖活性及效应因子IFN-γ分泌情况。（6）q RT-PCR筛选KIAA1199诱导PMN聚集的趋化因子,并进一步通过酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）实验证实。（7）分别在体外PMN趋化实验及体内小鼠经脾模型中使用CXCR2抑制剂,以进一步明确CXCL/CXCR2轴是KIAA1199介导PMN募集的核心物质基础。（8）免疫印迹（Western Blotting,WB）及免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测KIAA1199与TGF-β/SMAD3信号通路相关性。在体内外实验,分别应用TGFBRI/II抑制剂明确TGF-β/SMAD3信号通路为KIAA1199驱动的CXCL趋化因子上调,PMN募集及表型转化的关键因素。（9）系统地运用多种结肠癌肝转移模型,使用吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）靶向干预KIAA1199,小鼠体内观察与抗PD-1联合作用的疗效。（10）结合TCGA数据库,进一步验证KIAA1199 m RNA表达水平与PD-1阻断抗体疗效的相关性。结果:（1）针对CRC患者原发灶及配对肝转移灶免疫组化及免疫荧光结果显示:与原发灶相比,肝转移灶内KIAA1199基因的表达显著升高,CD66B+PMN浸润增多,而CD8+T细胞比例减少。随后,应用CIBERSORT方法评估TCGA CRC数据免疫细胞浸润比例,进一步验证了肿瘤组织KIAA1199 m RNA表达水平与瘤内PMN数量呈正相关,与CD8+T细胞浸润负相关。（2）通过基因工程技术成功构建KIAA1199过表达及敲低MC38结肠癌细胞系,接种于小鼠体内构建肝转移模型及原位瘤模型,结果显示:KIAA1199可促进小鼠肝转移灶形成,进一步对肝转移灶及原发灶流式分析显示KIAA1199可诱导肿瘤组织内PMN聚集,相反地,抑制CD8+T细胞浸润及IFN-γ的分泌。（3）应用抗体清除小鼠体内PMN可显著抵消KIAA1199引起的CRC增殖及肝转移形成能力。对原发灶及肝转移灶免疫细胞比例及功能定量分析,结果显示:清除PMN可上调瘤内CD8+T细胞聚集、增强杀伤T细胞活性,从而逆转KIAA1199介导的免疫耐受。此外,清除小鼠体内CD8+T细胞后,虽然肝转移数目均明显上升,但KIAA1199过表达组与对照组之间的肝转移形成差异也被削弱,以此进一步说明抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性是KIAA1199募集PMN的下游事件。（4）与KIAA1199较低表达的CRC细胞相比,KIAA1199高表达CRC细胞上清可显著诱导PMN迁移并重塑其表型向促瘤样极化,发挥抑制CD8+T细胞增殖及抗肿瘤活性功能。（5）应用q RT-PCR筛选及ELISA实验验证,KIAA1199上调肿瘤细胞合成及分泌CXCL1和CXCL3。（6）体外transewell实验发现,KIAA1199募集PMN的能力可分别被CXCL1、CXCL3中和抗体及CXCR2抑制剂阻断。体内经脾肝转移模型结果显示:使用CXCR2抑制剂可逆转KIAA1199介导的免疫抑制,显著减弱KIAA1199驱动的肝转移形成能力。（7）富集分析结果提示:KIAA1199与TGF-β/SMAD3信号通路密切相关,进一步行免疫印迹及Co-IP检测,结果提示:KIAA1199可能通过作用于TGF-β受体,继而活化下游的SMAD3。进一步通过基因工程技术过表达TGFBRII或使用小分子抑制剂抑制TGFBRI/II表达,结果表明:KIAA1199主要依赖TGF-β/SMAD3信号通路上调CXCL1/3表达,调控PMN募集并重编程其表型。我们在小鼠经脾肝转移模型中也观察到KIAA1199介导的PMN积累及T细胞的缺乏可被TGFBRI/II抑制剂阻断。（8）基因敲除或使用吡非尼酮抑制KIAA1199表达均可诱导肿瘤组织内大量CD8+T细胞浸润,增强对PD-1阻断抗体的敏感性。联合使用吡非尼酮及PD-1单抗可显著遏制结肠癌肝转移的发生发展。（9）KIAA1199在微卫星高度不稳定（High microsatellite instability,MSI-H）的CRC患者中表达显著低于微卫星稳定型（Microsatellite stable,MSS）或微卫星低度不稳定型（Low microsatellite instability,MSI-L）的患者。结论:本研究围绕“KIAA1199促进CRC肝转移”这一现象,系统地从分子、细胞、动物等水平,全方位论证KIAA1199作用于TGF-β受体,活化下游SMAD3信号通路,上调CXCL1/3趋化因子,进而募集PMN并重塑其促瘤样表型,抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性,最终导致肝转移灶形成这一连续事件及核心机制。应用吡非尼酮抑制表达,以打破KIAA1199介导的免疫逃逸,阻遏CRC细胞增殖及肝转移,并增加对PD-1单抗的敏感性。本研究有望为以KIAA1199为靶标的结直肠癌肝转移防治工作提供开创性的实验基础和理论依据。