研究背景人胶质瘤(glioma)是最为致命的原发性中枢神经系统肿瘤之一,不管是采取手术、放疗或者化疗,其预后效果极差,治疗后中位生存期(median survival)仅为12～15个月。探索胶质瘤的发病机制,寻找新的有效治疗靶点成为当前胶质瘤研究的热点。胶质瘤具有显著异质性的特征,表现为子代胶质瘤细胞的基因表达和表型同母代胶质瘤细胞截然不同,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、肿瘤侵袭及耐药性等方面表现出明显的恶化倾向。异质性是胶质瘤细胞不断进化并适应外界微环境从而导致恶性进展,以至最终逃避临床治疗的原因所在。本研究试图从基因角度阐明胶质瘤病理发展的分子生物学机制,这可能为胶质瘤的治疗提供新的方法。红芪多糖(Hedysarum polybotrys polysacchcrides,HPS)来自于多序岩黄耆的根部,是一种生物活性大分子物质。大量的研究显示,HPS既可以直接杀伤多种癌症肿瘤细胞,也可以通过免疫调节等间接方式抑制多种癌症的发展,但HPS对胶质瘤发生发展的影响尚无明确报道。UHRF2(ubiquitin like with PHD and RING finger domains 2,泛素样含 PHD 和环指域2)是一种泛素样蛋白,具有细胞周期调控、基因组稳定性调控、泛素-蛋白酶体调节以及表观遗传学调控等多方面的复杂功能。UHRF2基因在细胞周期调控中占据中心地位,被认为是一种潜在的抑癌基因。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一种长度包含18～27个核苷酸的单链小型非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNA)。miRNAs通过靶向结合mRNAs,诱导其转录后沉默进而调控基因的蛋白表达。近年来,miRNAs已经公认为是一类新的癌症治疗靶点。第一部分人胶质瘤组织UHRF2及相关miRNAs的表达特征研究目的探讨人胶质瘤及正常脑组织中UHRF2及相关miRNAs的表达水平差异,以及UHRF2同细胞周期蛋白cyclin E1/cyclin D1的表达水平相关性。方法收集30例通过手术切除的胶质瘤组织和10例非肿瘤性正常脑组织(normal brain tissue,NBT),其中包括14例低级别胶质瘤组织(low grade glioma,LGG,包括WHO Ⅰ级和WHO Ⅱ级胶质瘤)和16例高级别胶质瘤组织(high grade glioma,HGG,包括WHO Ⅲ级和WHO Ⅳ级胶质瘤)。采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法分析 UHRF2 mRNA 表达水平和 UHRF2相关 miRNAs(hsa-miR-196b-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-98-5p 和 hsa-miR-34a-5p)的表达水平。采用蛋白免疫印迹法检测UHRF2蛋白的表达水平,及其下游cyclins E1、cyclins D1蛋白的表达水平,并采用Pearson’s相关分析法观察UHRF2同cyclins E1以及UHRF2同cyclins D1的表达水平相关性。结果1.UHRF2mRNA和蛋白表达水平在NBT、LGG和HGG中随肿瘤恶性程度增高而逐渐降低,即UHRF2表达水平同人胶质瘤的恶性进展程度呈负相关。2.cyclins E1和cyclins D1的表达水平在NBT、LGG和HGG中随肿瘤恶性程度增高而逐渐升高,即cyclins E1和cyclins D1表达水平同人胶质瘤的恶性进展程度呈正相关。3.在人胶质瘤组织中,UHRF2同cyclins E1以及UHRF2同cyclins D1的表达水平均具有负相关性,提示人胶质瘤组织中,随着UHRF2表达水平的改变,cyclins E1和cyclins D1表达水平随之变化,呈负相关性。4.同NBT相比,UHRF2相关的4种miRNAs在胶质瘤组织中表达上调,其中hsa-miR-34a-5p表达上调最为明显。结论1.UHRF2水平同人胶质瘤的恶性进展呈负相关,cyclins E1和cyclins D1水平同人胶质瘤的恶性进展呈正相关,UHRF2的改变可能会造成cyclins E1和cyclins D1 的变化。2.hsa-miR-34a-5p是上调最为明显的UHRF2相关miRNAs。第二部分红芪多糖对人胶质瘤细胞的效应及对UHRF2的影响目的在体外水平上,观察HPS对人胶质瘤细胞的抗增殖作用以及细胞周期调控作用的影响。方法培养人胶质瘤 U251 细胞株,用 0 μg/ml、50 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml浓度的HPS溶液处理U251细胞48 hours,用MTT法检测HPS对U251细胞增殖的影响。用500μg/ml的HPS溶液处理U251细胞48hours,用PI染色和流式细胞法检测HPS对U251细胞周期的影响;用蛋白免疫印迹法检测U251细胞中UHRF2、cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax 蛋白的表达水平变化情况,并用 qRT-PCR 法检测 cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax 蛋白的 mRNA 表达水平变化情况。用包含UHRF2 cDNA的pcDNA-3.1质粒转染U251细胞,用蛋白免疫印迹法检测UHRF2过表达对cyclin E1、cyclin D1的表达水平影响。结果1.0μg/ml、50μg/ml、250μg/ml、500μg/ml 浓度的 HPS 溶液处理的 U251 细胞生长抑制率随HPS浓度增加而逐渐升高,并且以500μg/ml HPS溶液处理的U251细胞被阻滞于G0/G1期,提示HPS抑制U251细胞生长。2.500 μg/ml HPS溶液处理后,U251细胞的UHRF2蛋白表达水平明显升高,cyclin E1和cyclin D1的蛋白表达水平明显降低,促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53表达水平升高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低。3.UHRF2过表达诱导了 U251细胞的细胞周期蛋白cyclin El、cyclin D1表达减少,这一结果同HPS处理后UHRF2表达水平升高,cyclin E1和cyclin D1表达水平降低结果一致,提示HPS通过上调UHRF2表达,降低细胞周期蛋白cyclin E1、cyclin D1的表达,从而抑制U251细胞生长。结论1.HPS阻滞胶质瘤U251细胞周期于G0/G1期,抑制胶质瘤U251细胞生长。2.HPS通过上调UHRF2表达,降低cyclin E1和cyclin D1表达,抑制U251细胞生长,其作用同UHRF2过表达的作用效果相一致。第三部分 红芪多糖经mi RNA-34a-5p/UHRF2轴抑制人胶质瘤细胞的机制研究目的从UHRF2及其相关miRNAs角度分析HPS影响胶质瘤细胞发生发展的潜在分子生物学机制。方法构建包含UHRF2 3’-UTR的野生型(wt UHRF2 3’-UTR)或突变型(mut UHRF23’-UTR)荧光素酶报告基因载体,同miRNA-34a-5p mimic或者NC mimic共转染,检测共转染48hours后的荧光素酶活性。转染miRNA-34a-5p mimic后,用500μg/ml浓度的HPS溶液处理胶质瘤U251细胞48hours,用qRT-PCR法检测miRNA-34a-5p的表达水平,并用蛋白免疫印迹法检测UHRF2、cyclin E1、cyclin D1的蛋白表达水平变化,以及通过MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖水平。结果1.wt UHRF2 3’-UTR和miRNA-34a-5p mimic共转染后,荧光素酶活性显著降低,证实在胶质瘤U251细胞中,miRNA-34a-5p直接靶向作用于UHRF2基因。2.500μg/ml HPS溶液处理U251细胞后,miRNA-34a-5p表达水平显著降低;经HPS处理、miRNA-34a-5p mimic转染联合作用后,U251细胞中miRNA-34a-5p表达水平显著上调。3.miRNA-34a-5p过表达下调了被HPS增强表达的UHRF2表达水平,上调了被HPS降低表达的cyclin E1、cyclin D1表达水平。结论1.HPS 抑制 miRNA-34a-5p 的表达。2.miRNA-34a-5p直接靶向作用与UHRF2基因,逆转了 HPS升高UHRF2以及降低cyclin E1、cyclin D1表达水平的作用。3.HPS抑制的U251细胞增殖可被miRNA-34a-5p过表达所逆转。第四部分 红芪多糖对荷胶质瘤裸鼠肿瘤生物学特性的影响目的在体内水平上,探讨研究HPS对人胶质瘤细胞的抗增殖作用及对人胶质瘤动物模型生物学特性的影响。方法将胶质瘤U251细胞接种于免疫缺陷裸鼠皮下,建立人胶质瘤异种移植模型鼠,然后以150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量对荷胶质瘤裸鼠进行灌胃治疗,同时设计400 mg/kg HPS灌胃和miRNA-34a-5p mimic瘤内注射实验组。胶质瘤U251细胞接种模型鼠后,每4天检测肿瘤体积变化,第24天时剥离并称量肿瘤的重量,并用蛋白免疫印迹法检测肿瘤内cyclin E1、cyclin D1、p53、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。结果1.150mg/kg、400mg/kg HPS给药剂量可抑制荷瘤裸鼠体内异种移植瘤的体积增长和重量增加,并且这种抑制作用的强弱同HPS的剂量呈正相关性;然而miRNA-34a-5p过表达可逆转HPS的抗胶质瘤作用,诱导胶质瘤的生长。2.150 mg/kg、400 mg/kg HPS 剂量处理组肿瘤内 cyclin E1 和 cyclin D1 表达水平明显降低,促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53表达水平升高,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,然而miRNA-34a-5p过表达可逆转HPS的此种作用,上调cyclin E1、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax和p53蛋白表达水平。结论1.HPS通过下调细胞周期相关蛋白cyclin E1、cyclin D1,上调促凋亡相关蛋白Bax和抗肿瘤相关蛋白p53的水平,降低抗凋亡相关蛋白Bcl-2的水平,进而在体内水平抑制人胶质瘤的生长。2.miRNA-34a-5p逆转HPS的体内抗胶质瘤生长作用。第五部分 红芪多糖对荷胶质瘤裸鼠免疫调控的影响目的观察HPS对人胶质瘤动物模型免疫系统功能的影响。方法采用鸡红细胞刺激法,检测荷胶质瘤裸鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数。收集各组裸鼠血清,采用ELISA法检测血清中TNF-α和caspase-3的浓度。结果1.150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量能够提高荷胶质瘤裸鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数,增强裸鼠的免疫功能,然而miRNA-34a-5p过表达降低了腹腔巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数,降低裸鼠的免疫功能。2.150mg/kg、400mg/kg的HPS剂量能够上调荷瘤裸鼠血清中下降的TNF-α和caspase-3浓度,然而miRNA-34a-5p过表达阻遏了 HPS的这种上调作用。结论HPS可增强荷瘤裸鼠的免疫功能,miRNA-34a-5p过表达阻遏了 HPS的免疫增强作用。