论文部分内容阅读
目的:β1,3乳糖基转移酶7(β3GalT7)是本课题组首先在国际上克隆获得的人类糖基转移酶新基因,通过同源序列比对确定其属于β3糖基转移酶大家族的β3半乳糖基转移酶家族,这个酶的催化功能已通过实验验证,本文旨在对其浸润转移等肿瘤相关性功能进行进一步的验证研究。同时,对β1,3半乳糖基转移酶7的表达是否受到转录因子caveolin-1的调控进行初步性的探索研究。方法:1、验证真核正义、真核反义和RNA干扰表达载体,通过运用脂质体介导转染克隆β3GalT7真核正义、真核反义和RNA干扰表达载体入中度表达该基因的人喉癌细胞株Hep-2, ,通过G418筛选,建立一系列旨在改变喉癌细胞株Hep-2β3GalT7基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR及Western印迹检测正义、反义和干扰封闭β3GalT7基因RNA表达后增殖以及喉癌细胞株Hep-2中TGF-β、MMP2等表达水平的变化及裸鼠成瘤,在动物实体水平深入研究。2、合成转录因子caveolin-1的反义核苷酸序列并用FITC荧光标记,将反义核苷酸序列转染4种不同的实体瘤细胞株,通过激光共聚焦显微镜观察转染效果和确定转染位置,用RT-PCR鉴定caveolin-1mRNA表达的受抑制情况,利用RT-PCR和Western blot分别分析4种细胞株转染前后β3GalT7在mRNA水平和蛋白水平的表达变化,并通过共转染进一步探讨其相关性。结果:1.显示正义封闭β3GalT7基因表达后,喉癌细胞株Hep-2β3GalT7的表达水平有所提高,细胞分裂增殖加快,而反义和干扰封闭β3GalT7基因表达后,喉癌细胞株Hep-2β3GalT7的表达水平明显降低,细胞分裂增殖减慢,且以干扰封闭的更明显。表明三种封闭β3GalT7基因表达对喉癌细胞株Hep-2的生长增殖有影响。结果还显示,正义封闭β3GalT7基因表达可使TGF-β、MMP2等基因在mRNA与蛋白质表达水平均增加,而反义和干扰封闭β3GalT7基因表达可使TGF-β、MMP2等基因在mRNA与蛋白质表达水平均降低。提示β3GalT7基因表达可能对喉癌细胞株Hep-2浸润转移产生影响,且裸鼠成瘤。以上结果表明,β3GalT7基因可能与肿瘤的增殖及浸润转移相关.2、通过激光共聚焦观察发现caveolin-1反义核苷酸的转染效率在90%以上,大部分在细胞核周,RT-PCR结果也显示caveolin-1的mRNA表达受到明显的抑制;RT-PCR和Western blot结果显示β3GalT7的mRNA和蛋白表达都随着转录因子caveolin-1的抑制而提高,且共转染显示两者共同作用对肿瘤浸润转移作用明显。结论:细胞水平及裸鼠实体成瘤实验证明β3GalT7基因与肿瘤的浸润转移之间具有一定的相关性,更深入的机制则有待进一步的实验研究。初步发现β3GalT7与转录因子caveolin-1存在一定的负相关性。