目的:肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种大脑皮层、脑干和脊髓前角运动神经元选择性受累的神经系统变性疾病,表现为肌肉渐进性萎缩、无力、瘫痪和吞咽困难,并最终在2到5年内因呼吸肌麻痹死亡。目前该病发病机制不清,但流行病学研究发现ALS发病存在性别差异,这表明ALS发病的性别差异可能源于雌激素(Estrogen,E)对神经元的保护作用。有研究证明雌激素作为一种神经保护因子在许多神经变性模型中具有促进神经元生存,保护组织完整性的作用。神经系统中的雌激素可以由局部组织的芳香化酶产生。数篇研究报道芳香化酶在脑内有表达,且脑内雌激素的有效浓度及保护作用取决于脑局部芳香化酶的表达水平。以往有关于去卵巢后SOD1G93A转基因鼠的发病影响的研究结果有争议。本实验通过观察去卵巢对SOD1G93A转基因鼠发病时间、生存期及行为学影响,探讨循环雌激素对脊髓前角神经元的作用,并应用免疫组化的方法观察脊髓芳香化酶的表达情况初步探讨卵巢切除对家族性肌萎缩侧索硬化鼠模型的影响机制。方法:1模型建立及分组饲养繁殖家族型肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1G93A转基因雌性小鼠,随机将40只5周龄携带SOD1G93A基因的小鼠分为三个实验组(n≧12只):分别为卵巢切除组(OVX)、假手术组(Sham)、阳性对照组(NO-OVX)。阴性对照组(CON)组为同月龄未转人突变的SOD1基因的小鼠。2发病时间和死亡时间的判定每天早晚各观察一次转基因鼠的一般状况。评分标准参考Vercelli等人研究的1-5分评分法[Vercelli A et al.,2008],评分为4分时定为发病时间,评分为1分时定为死亡时间。3行为学观察应用一般状况评分、体重测量、转棒实验、悬绳实验、步长测量等对小鼠的行为学进行观察。4免疫组化染色固定的组织块震荡切片25μm厚,应用免疫组织化学SP的方法,观察芳香化酶在SOD1G93A转基因小鼠症状前期、症状期及终末期各个组腰段脊髓的表达分布特征。镜下计数脊髓两侧前角芳香化酶免疫阳性α运动神经元数量,计数标准:位于脊髓前角,d>25微米,有明显核仁。同时采用Im-age Pro Plus 6.0全自动图像分析系统,测显微镜(10x10倍)下中央管至脊髓前角范围内芳香化酶的吸光度,每只小鼠选择5张脊髓切片,计算每张切片的累积光密度值(IOD)。5统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计处理。计量资料采用均数±标准差表示,数据的比较采用单因素方差分析或秩和检验,两组数据比较采用t检验,以a=0.05为显著性检验标准。结果:1 SOD1G93A转基因小鼠的鉴定子代鼠基因组DNA(见Fig.1):位于200-300bp之间的条带(236bp)为m SOD1的PCR产物,此种小鼠为SOD1G93A转基因阳性小鼠。没有此条带为未转基因小鼠即阴性小鼠。2发病时间和生存时间OVX组发病时间78.07±3.091天,与NO-OVX组92.50±3.907天相比,P=0.008。Sham组发病时间83.50±3.598天,与NO-OVX组92.50±3.907天相比,P=0.107。OVX组与Sham组相比P=0.26(见Table.1和Fig.2a)。OVX组的生存期137.71±2.352天,与NO-OVX组137.93±2.215天,相比P=0.738,Sham组生存期为132.08±2.932天,与NO-OVX组137.93±2.215天的相比,P=0.08均无统计学差异(P>0.05,见Table.1和Fig.2b)。3行为学3.1体重从第9周到第10周,四个实验分组均无统计学差异。从第11周到第14周只有OVX组与CON组小鼠有统计学差异。从第15周起三个阳性组(OVX组、Sham组、NO-OVX组)与CON组相比均有统计学差异(见Fig.3 a)。3.2悬吊实验从第9周到第10周,四个实验组的悬吊时间均无统计学差异。从第11周起至第20周三个阳性组的悬吊时间与CON组相比均有统计学差异(见Fig.3 b)。3.3转棒实验从第9周到第14周,四个实验组的转棒时间均无统计学差异。第15周OVX组的转棒时间与CON组相比有统计学差异。从第16周到第20周转棒时间三个阳性组与CON组相比均有统计学差异。然而,OVX组与Sham组从始到尾均未出现统计学差异,OVX组与NO-OVX组也未出现统计学差异(见Fig.3 c)。3.4步长测量从第9周到第15周,四个实验组的步长测量无统计学差异。从第16周到第20周三个阳性组的步长与CON组相比均有统计学差异。然而,OVX组与Sham组从始到尾均未出现统计学差异,OVX组与NO-OVX组也未出现统计学差异(见Fig.3 d)。4免疫组化染色4.1症状前期,各组的芳香化酶在脊髓前角的表达,主要分布于α运动神经元胞浆,胶质细胞未见表达。阳性神经元计数分别为OVX 20.20±6.603,Sham 20.07±4.877,NO-OVX 17.07±4.978及CON 21.53±5.343,各组相比P>0.05,差异无统计学意义。4个实验组IOD分别为:OVX 7516±2357,Sham 6493±2106,NO-OVX 5775±1543,CON 4904±1190,各组相比P>0.05,差异无统计学意义(见Fig.4)。4.2症状期,CON组小鼠芳香化酶表达无明显变化;OVX组、Sham组及NO-OVX组脊髓前角芳香化酶阳性的α运动神经元减少,可见到胶质细胞形态的细胞表达。芳香化酶α运动神经元数目:OVX 8.27±4.543,Sham 6.87±2.973,NO-OVX 9.33±4.701,CON 18.73±5.063。应用方差分析P>0.05无统计学差异。IOD分别为:OVX 4554±1797,Sham 5739±1382,NO-OVX 5933±2002,CON 4841±1965。应用方差分析P>0.05无统计学差异(见Fig.5)。4.3终末期,CON组小鼠芳香化酶仍在脊髓前角α运动神经元表达;OVX组、Sham组及NO-OVX组脊髓前角芳香化酶阳性的α运动神经元明显减少,甚至消失,但可见到胶质细胞形态的细胞表达增加。芳香化酶α运动神经元数目:OVX 0.6±0.737,Sham 3.13±1.846,NO-OVX 2.20±1.568,CON22.53±3.642。OVX组与其它实验组比较P<0.05,存在统计学差异。IOD分别为:OVX 9502±2243,Sham 8072±2543,NO-OVX 8216±2002,CON 4740±1511。OVX组与Sham组比较P=0.007;OVX组与NO-OVX组比较P=0.024;其他两两比较均无统计学差异(见Fig.6)。结论:1卵巢切除可使SOD1-G93A转基因鼠提前发病,但对生存期及其运动功能无明显影响。2 SOD1G93A基因突变可以诱导脊髓前角的胶质细胞表达芳香化酶。3卵巢切除可能导致SOD1G93A转基因脊髓局部雌激素合成增加。