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研究背景肝细胞癌在我国是常见的恶性肿瘤之一,是原发性肝癌的主要类型之一。然而其发病机制尚未完全阐明,肝癌的发生发展是一个涉及多基因的变化、多因素、多步骤的连续过程。近年来研究发现,表观遗传学的改变在肝癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化(DNAmethylation),基因组印记(genomic impriting),母体效应(maternal effects),基因沉默(gene silencing),核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑(RNA editing)等。其中抑癌基因RUNX3启动子区域的CpG岛被甲基化,导致该基因的表达沉默,成为近些年来研究肝癌相关发生发展机制及治疗的热点之一。研究报道,肝癌细胞中抑癌基因RUNT相关转录因子3(Runt-related transcription factor3, RUNX3)由于CpG岛启动子高甲基化,其在mRNA水平及蛋白水平表达明显下调。5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)是一种核苷酸类甲基转移酶抑制剂,也可以对DNA甲基转移酶进行特异性抑制,使DNA甲基化程度下降,进而逆转因甲基化而沉默的基因重新开始表达。在肝癌组织中RUNX3基因CpG岛甲基化的相关研究已有不少报道,而5-Aza-dC在肝癌细胞系SMMC-7721中对该基因甲基化状态影响的研究尚不多见。目的探讨去甲基化制剂5-Aza-dC对肝癌细胞株SMMC-7721抑癌基因RUNX3甲基化状态、mRNA表达水平及肝癌细胞生长周期的影响。材料与方法肝癌细胞SMMC-7721由河南省肿瘤医院中心实验室所赠,选择在RPMI-1640培养液(10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml)中培养,培养液置于37℃,饱和湿度的细胞培养箱中。每2到3天换液传代1次。并分为对照组(不进行加药处理)和5-Aza-dC处理组。1不同浓度的5-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因启动子区域甲基化状态的影响：分别以O.5μmol/L、1.5μmol/L、4.5μmol/L、13.5μmol/L、浓度的5-Aza-dC培养肝癌细胞SMMC-772172h,提取细胞DNA,参照甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)技术,分别设计甲基化和非甲基化引物,检测两组肝癌细胞RUNX3基因启动子区域的甲基化状态。2不同浓度的5-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因mRNA的作用：分别以0.5μmol/L、1.5μmol/L、4.5μmol/L、13.5μmol/L浓度的5-Aza-dC培养肝癌细胞SMMC-772172h,提取细胞RNA,应用RT-PCR(Real-time PCR)技术检测两组肝癌细胞SMMC-7721中RUNX3mRNA表达的影响。3不同浓度的5-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721细胞周期的影响：分别以0.5μmol/L、1.5μmol/L、4.5μmol/L、13.5μmol/L浓度的5-Aza-dC培养肝癌细胞SMMC-772172h,收集细胞,使用流式细胞术(FCM)检测两组肝癌细胞SMMC-7721细胞周期的影响。4统计学处理：采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析,结果以均数±标准差(x±s)表示,以p<0.05为差异有统计学意义。结果1不同浓度的5-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因启动子区域甲基化状态的影响：MSP结果显示,对照组肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因启动子区域存在高甲基化。在分别以0.5μmol/L、1.5μmol/L、4.5μmol/L、13.5μmol/L浓度的5-Aza-dC培养肝癌细胞SMMC-772172h后,肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因启动子区域甲基化状态随药物浓度增加而出现不同程度的逆转,逆转程度呈现出药物浓度依赖性的趋势；25-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721RUNX3基因mRNA的影响：RT-PCR检测结果发现,对照组肝癌细胞SMMC-7721RUNX3mRNA未能检测到表达,经过O.5μmol/L、1.5μmol/L、4.5μmol/L、13.5μmol/L浓度的5-Aza-dC作用72h后,RUNX3的mRNA相对表达量分别为0.33±0.04、0.94±0.08、1.23±0.05和1.90±0.03,RUNX3的mRNA水平出现再表达,并呈现出浓度依赖方式增加。双变量相关分析说明RUNX3mRNA水平与5-Aza-dC的浓度呈显著正相关(r>0.95,P<0.05),差异有统计学意义。35-Aza-dC对肝癌细胞SMMC-7721生长周期的影响：FCM结果显示,不同浓度5-Aza-dC作用72h后,肝癌细胞SMMC-7721S期细胞比例随药物浓度增加而增加,提示5-Aza-dC可以诱导肝癌细胞SMMC-7721阻滞于S期。S期细胞比率与5-Aza-dC的浓度呈显著性正相关(r>0.95,P<0.02)。结论肝癌细胞SMMC-7721抑癌基因RUNX3启动子区域处于高甲基化状态。5-Aza-dC可逆转肝癌细胞SMMC-7721抑癌基因RUNX3启动子区域的甲基化状态,使得因甲基化而失活的RUNX3基因再表达,发挥抑癌作用,并可诱导肝癌细胞株SMMC-7721阻滞于S期,该作用随药物浓度增加而增强,从而抑制肿瘤生长。