研究背景：子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma, EC)在育龄期至绝经后的任何年龄段均可发生,是除宫颈癌、卵巢癌之外的第三大妇科恶性肿瘤。子宫内膜癌的发病率居高不下,国内外研究均显示呈逐年上升趋势,且越来越年轻化,在发达国家如美国其发病率高居女性生殖系统癌症首位,约占50%。在我国每年因该病死亡的病例数占女性生殖道恶性肿瘤的第二位,且每年有20万的新发病例,发病高峰年龄位于50-69岁。子宫内膜癌严重危害女性健康,并且日益受到广泛关注,但其发病机制尚未充分阐明。子宫内膜癌绝大部分为雌激素依赖型(即Ⅰ型)子宫内膜样腺癌,据临床观察,手术病理证实为雌孕激素受体阳性的早期内膜癌患者术后追加高效的孕激素治疗可抑制肿瘤复发。再者,基因相关的如抑癌基因发生突变、沉默,癌基因发生过表达,以及微卫星不稳定和杂合性缺失等是子宫内膜癌发病的可能分子机制。经脉管系统的侵袭和转移机制是肿瘤患者致死的主要原因,脉管系统包括血管和淋巴管。有研究表明,在发生淋巴结转移的肿瘤基质中,常能发现淋巴管的增生和扩张。淋巴转移是除直接蔓延外子宫内膜癌的另一主要转移途径,因肿瘤细胞沿淋巴系统扩散给临床治疗带来了巨大挑战,是治疗效果差甚至失败的重要原因,故发生淋巴转移的病例预后较差。血管中的血液携氧,为肿瘤生长提供所需的营养,缺少血管,肿瘤生长则受到抑制,只能达到1-2mm3大小且一般不发生转移,因此肿瘤的生长和转移离不开血管的生成。新生血管形成之后,肿瘤细胞呈指数倍增,侵袭转移机会顺应性增加。在调控血管生成的多种因子中,发挥最强刺激作用的当属血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)及其受体家族。VEGF的分子量从35至44kDa不等,包括VEGF-A,-B(包括VEGF-B167以及VEGF-B186),-C,-D,及-E六个等型,每个等型特异性地与三个血管内皮生长因子受体(VEGFR-1,-2,-3)的特定组合相结合。近年来倾向于对VEGF-C、VEGF-D的研究,发现它们对淋巴管的影响较血管更为突出,一些实验也已证明在肿瘤侵袭和淋巴管转移过程中VEGF-C起到了关键作用。VEGF-C、VEGF-D与VEGFR-3特异性相结合,诱导VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化,因VEGFR-3主要表达于淋巴管内皮细胞,故易引起淋巴管新生、增生和扩张,从而导致肿瘤转移。低分化肿瘤细胞能够分泌VEGF-C,激活其受体,从而发生上述反应。这一发现在Da等的研究中也得到了验证,同时他还指出检测到VEGF-C过表达是提示肿瘤是否发生早期淋巴转移的一项指标。环氧合酶2(Cyclooxygenase-2, COX-2)高表达与子宫内膜癌的发病密切相关,且与VEGF在一些恶性肿瘤淋巴转移中的协同作用已经得到证实。Fujiwaki等报道,COX-2与肿瘤组织中微血管密度相关,它表达于子宫内膜癌的上皮细胞而非间质细胞,可能是VEGF的上游因子,并通过诱导VEGF表达介导微血管和淋巴管生成,从而参与肿瘤的转移。葡萄糖转运蛋白1(Glucose Transporter-1,GLUT-1)在哺乳动物胚胎和成熟组织中低水平广泛表达,它作为跨膜转运葡萄糖的一种重要载体,主要为组织细胞提供基础糖需求。研究表明,GLUT-1在部分癌组织及具有癌变潜能的非典型增生组织中表达上调。当微环境缺氧时,为满足能量需求,细胞对葡萄糖的吸收、利用增加。而缺氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α)可介导缺氧反应,上调GLUT-1的表达来加速糖代谢过程。DNA曾被认为是生命遗传信息的核心物质,但是遗传信息不是基因能够完全决定的,由此表观修饰遗传学成为我们认识基因组的新视点,即不影响DNA序列,单纯改变基因组修饰就可影响个体发育并且遗传下去。作为表观遗传学的主要表现形式,DNA甲基化的作用显得尤为突出,它是一种由酶介导的化学修饰,能够调节基因功能,是脊椎动物DNA唯一一种自然共价修饰方式,亦可导致人类多种疾病的发生和发展,特别是与恶性肿瘤的发病机制密切相关,是肿瘤发生过程中除基因突变和杂合性缺失外,抑癌基因失活的第三种机制。正常细胞的CpG岛处于非甲基化状态,当抑癌基因启动子区CpG岛发生甲基化时,导致基因表达沉默,抑癌功能丧失。另有研究报道,低甲基化在肿瘤发展或致癌过程中扮演重要角色,它导致基因组不稳定性增加,并且增加基因突变的频率。Duan等对胃癌的研究证实了VEGF-C启动子低甲基化与胃癌发病的相关性。因VEGF在子宫内膜癌组织中高表达已实验得到证实,我们有理由怀疑VEGF-C启动子异常甲基化(尤其是低甲基化或去甲基化)与子宫内膜癌的发生发展密切相关。目前最有前途的肿瘤治疗方法之一是抗肿瘤血管及淋巴管生成,且有望成为肿瘤患者的福音。关于VEGF甲基化状态与子宫内膜癌侵袭、转移关系的研究尚无报道,我们按照该设想开展实验研究。本实验通过检测各组子宫内膜组织(包括正常子宫内膜、单纯增生内膜、复杂增生内膜、不典型增生内膜和内膜癌)中VEGF-C的甲基化状态,分析VEGF-C启动子异常甲基化与子宫内膜癌发生发展的相关性,并首次联合检测VEGF、COX-2、 GLUT-1和HIF-1 α蛋白表达与子宫内膜癌侵袭、转移的关系。因DNA甲基化主要是使基因抑癌功能丧失或减弱,我们使用5-aza-dC诱导子宫内膜癌细胞系去甲基化,检测VEGF-C mRNA表达水平的改变、甲基化状态的变化以及对生物学行为的影响,以进一步探讨VEGF-C启动子甲基化在子宫内膜癌侵袭、转移中的作用。第一部分子宫内膜癌组织VEGF-C启动子甲基化状态检测目的：检测子宫内膜癌(EC)、子宫内膜增生(包括单纯性增生(Simple hyperplasia、复杂性增生(Complex hyperplasia, CH)和不典型增生(Atypical hyperplasia, AH))和正常子宫内膜(Nomal endometrium, NE)组织中VEGF-C mRNA的表达及其启动子的甲基化状态,并分析两者的相关性,初步探讨VEGF-C启动子异常甲基化在子宫内膜癌发生、发展过程中的作用。方法：RT-PCR方法和甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)方法分别检测各组子宫内膜组织中VEGF-C mRNA的表达情况和VEGF-C启动子的甲基化状态。结果：1.各组子宫内膜组织VEGF-C mRNA的表达情况子宫内膜癌和不典型增生子宫内膜组织中VEGF-C mRNA的表达阳性率较高,分别为91.7%(55/60)和83.3%(20/24),而在复杂性增生内膜中VEGF-C mRNA的表达率明显下降,仅为28.6%(4/14),在单纯性增生和正常子宫内膜中均只检测到1例有VEGF-C mRNA表达,阳性率分别为4.5%(1/22)和1.7%(1/60)。VEGF-C mRNA的表达水平在子宫内膜癌中明显高于正常子宫内膜、单纯增生内膜和复杂增生内膜组织(P<0.01),差异有高度统计学意义,而和不典型增生内膜组差异不明显(x2=1.244,P>0.05)。不典型增生组明显高于复杂增生组(x2=11.396,P<0.01)和单纯增生组、正常子宫内膜组(P<0.01),差异具有高度统计学意义。复杂增生组明显高于单纯增生组和正常子宫内膜组(X2=4.129,13.042,P<0.05,0.01)。单纯增生组和正常子宫内膜组织差异不明显(x2=0.561,P>0.05)。见图1,表1、3,图表12.各组子宫内膜组织VEGF-C启动子区甲基化状态的检测情况正常子宫内膜和单纯增生内膜组织中VEGF-C启动子甲基化率较高,分别为83.3%(50/60)和81.8%(18/22),复杂增生组、单纯增生组和子宫内膜癌组甲基化率依次降低,其中内膜癌组中甲基化率仅15%(9/60)。正常子宫内膜和单纯增生组、复杂增生组甲基化差异不明显(x2=0.026,1.049,P>0.05),而和不典型增生组、内膜癌组相比差异有高度统计学意义(x2=33.185,56.049,P<0.01)。单纯增生组和复杂增生组相比无明显差异(x2=0.534,P>0.05),而和不典型增生组、内膜癌组相比差异明显(x2=19.526,32.542,P<0.01)。复杂增生组VEGF-C甲基化率明显高于不典型增生和内膜癌组(x2=11.396,18.941,P<0.01),差异有高度统计学意义。不典型增生组和内膜癌组间差异不明显(x2=0.036,P>0.05)。见图2、3,表2、3,图表23.VEGF-C启动子甲基化状态与子宫内膜癌临床病理特征的关系子宫内膜癌组织VEGF-C启动子甲基化率与年龄、手术病理分期、组织病理分级无关(P>0.05),与淋巴转移关系密切,病理证实无淋巴转移者与有淋巴转移者相比差异有统计学意义(x2=9.804,P<0.05)。见表44.各组子宫内膜组织VEGF-C mRNA表达和启动子甲基化的关系正常子宫内膜和单纯增生内膜→复杂增生内膜→不典型增生内膜→子宫内膜癌组织中VEGF-C mRNA表达水平依次升高,而启动子区甲基化程度依次减弱。但二者无明显相关性(r=-0.104,P>0.05)。结论：1.VEGF-C mRNA高表达的组织通常甲基化率低,反之,甲基化率高,二者呈相反趋势,但无直接相关性。2.VEGF-C基因启动子区CpG岛的去甲基化或低甲基化状态可能导致基因组不稳定性增加,并参与了子宫内膜癌的发生。3.VEGF-C启动子甲基化状态在子宫内膜癌的侵袭转移过程中可能发挥重要作用。4.子宫内膜癌组织中VEGF-C基因启动子呈低甲基化状态,调控和干预VEGF-C的甲基化状态将可能成为子宫内膜癌治疗的新方向。趋势,但无直接相关性。第二部分子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1、HIF-1α的蛋白表达目的：检测子宫内膜癌、子宫内膜增生(包括单纯性增生、复杂性增生和不典型增生)和正常子宫内膜组织中VEGF、COX-2 GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达情况,以及上述蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系。方法：免疫组织化学法检测各组子宫内膜组织4种基因的蛋白表达情况,并进行两两比较,验证其相关性及与子宫内膜癌临床病理特征的关系。结果：1.各组子宫内膜组织4种蛋白的表达情况VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α在正常内膜组、单纯增生组、复杂增生组、不典型增生组和内膜癌中蛋白表达阳性率依次升高。正常内膜组和单纯增生组相比无明显差异(x2=2.517,0.067,0.752,2.761,P>0.05),而和复杂增生组、不典型增生组、内膜癌组相比差异均有高度统计学意义(x2=13.042,24.102,52.004；x2=2.663,23.671,38.763；x2=2.663,30.199,57.416；x2=13.400,42.000,91.765,P均<0.01)。单纯增生组和复杂增生组相比无明显差异(x2=2.338,1.063,3.328,2.469,P>0.05),而和不典型增生组、癌组相比,差异有高度统计学意义(x2=7.111,20.790；x2=10.148,16.884；x2=16.611,31.570；x2=15.112,47.492,P均<0.01)。VEGF在复杂增生组中的表达与不典型增生组相比无明显差异(x2=0.652,P>0.05),与内膜癌组相比差异有显著性(x2=5.589,P<0.05)。COX-2、GLUT-1和HIF-1α在复杂增生组中的表达与不典型增生组和内膜癌组相比差异均有统计学意义(x2=3.91,7.549；x2=5.886,14.617；x2=4.871,25.316,P均<0.05)。VEGF、COX-2和GLUT-1在不典型增生组的表达与在内膜癌组相比差异均不明显(x2=3.286,0.578,1.901,P均>0.05),而HIF-1 α在两组间的表达有明显差异(x2=8.174,P<0.01)。见表1、图表12.复杂增生、不典型增生内膜和内膜癌组织中4种蛋白的表达情况复杂增生内膜、不典型增生内膜和内膜癌三组相比,VEGFCOX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达水平有明显差异(x2=7.164,7.571,14.689,25.412,P<0.05)。见表23.4种蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1a的蛋白表达水平与年龄无关,与手术病理分期、组织病理分级和有无转移密切相关(P<0.01或<0.05),且随着分期越晚、分化程度越差,蛋白表达越强,有转移者较无转移者表达阳性率高。见表34.子宫内膜癌组织中4种蛋白表达的相互关系子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α的蛋白表达两两比较均呈正相关。结论：1.子宫内膜癌组织中VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α蛋白均呈阳性表达,提示以上4种基因与子宫内膜癌的发病密切相关。2.VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α基因在子宫内膜癌的发生发展过程中起协调作用或促进作用。3.实验表明,VEGF在复杂增生内膜的表达与不典型增生内膜相比无明显差异,与其他三种基因相反；HIF-1 α在不典型增生内膜和内膜癌中的表达差异明显,而其他三种基因在两种组织中则无明显差异。可能是实验误差导致,亦说明四种基因存在协同机制,通常组织恶性程度越高,蛋白表达越高,但并非每种基因均与内膜癌存在明显相关性。4.VEGF、COX-2、GLUT-1和HIF-1α基因可能在子宫内膜癌的侵袭、转移过程中发挥重要作用,研发上述基因的抑制剂将可能成为抑制子宫内膜癌侵袭转移、改善患者预后的新方法。第三部分子宫内膜癌细胞系中VEGF-C基因启动子甲基化状态目的：培养4种子宫内膜癌细胞系HEC-1A、Ishikawa, RL-952、HHUA,检测其VEGF-CmRNA和蛋白表达情况以及启动子区的甲基化状态,应用去甲基化药物5-aza-dC处理细胞系,分析药物作用前后VEGF-C mRNA和蛋白表达水平、甲基化状态的改变及细胞生物活性的变化,探讨子宫内膜癌发生的可能机制及治疗思路。方法：细胞培养,继续采用RT-PCR方法检测4种子宫内膜癌细胞系去甲基化药物作用前后VEGF-C mRNA的表达；VEGF-C启动子区甲基化状态和VEGF-C蛋白表达的改变分别采用MSP法和Western Blot法检测,并用MTT和流式细胞术观察药物对细胞生物活性的影响。结果：1.4株子宫内膜癌细胞系中均检测到VEGF-C mRNA表达纳入本实验的4株人子宫内膜癌细胞系HEC-1A、Ishikawa、RL-952和HHUA均培养至对数生长期,分别提取细胞总RNA和总DNA,并检测细胞RNA的浓度。同时取1例正常子宫内膜的RNA作对照。接着进行逆转录,采用RT-PCR方法检测子宫内膜癌细胞系中VEGF-C mRNA的表达水平。结果显示：4株子宫内膜癌细胞系均检测到VEGF-C mRNA的表达,而正常子宫内膜组织未检测到。见图12.4株子宫内膜癌细胞系中部分发生VEGF-C启动子甲基化采用MSP方法检测4株子宫内膜癌细胞系VEGF-C启动子的甲基化状态,结果显示HEC-1A、Ishikawa和RL-952细胞系检测到VEGF-C启动子甲基化,而HHUA细胞系未检测到,表现为仅USP-primer有扩增产物,MSP-prime r无扩增产物。其中HEC-1A为完全甲基化,表现为仅MSP-primer有扩增产物USP-primer无扩增产物。Ishikawa和RL-952发生了部分甲基化,表现为扩增产物同时出现在M组和U组,但电泳结果以非甲基化为主。见图2。3.去甲基化药物5-aza-dC(10μM)处理子宫内膜癌细胞系后,细胞基因组发生了去甲基化,VEGF-C mRNA的表达水平受到抑制取对数生长期的子宫内膜癌细胞系,当细胞密度为1×105时接种于六孔板内,建立对照组(未经药物处理组)、空白对照组(培养液代替药物组)和实验组(10μM5-aza-dC药物处理组),96h后收集细胞并提取细胞的总RNA和基因组DNA,采用RT-PCR方法检测VEGF-C mRNA的表达水平,比较药物作用前后表达水平的变化。结果表明,细胞经去甲基化药物作用后,VEGF-C mRNA的表达受到抑制,HEC-1A细胞变为部分甲基化,Ishikaw细胞仍为部分甲基化,RL-952细胞变为去甲基化状态。见图34.去甲基化药物5-aza-dC处理子宫内膜癌细胞系后VEGF-C蛋白表达降低Western Blot检测4株子宫内膜癌细胞系VEGF-C蛋白的表达情况,结果显示4株细胞系中均检测到VEGF-C蛋白的表达,去甲基化药物5-aza-dC处理细胞后,VEGF-C蛋白表达水平降低,且与对照组和空白对照组相比差异有显著性(P<0.01),而对照组和空白对照组组间比较无明显差异(P>0.05),说明去甲基化药物抑制了VEGF-C的基因转录功能,使蛋白表达降低。见图4、表1、图表15.MTT检测5-aza-dC作用于子宫内膜癌HEC-1A细胞后的增殖能力变化通过检测去甲基化药物5-aza-dC对HEC-1A细胞作用的时效关系,结果表明经10μM 5-aza-dC处理24h,48h,72h、96h后,细胞增殖能力受到抑制,细胞活力下降,作用时间越长,这种反应越明显。见图56.FCM检测细胞经去甲基化药物处理后的凋亡现象子宫内膜癌细胞株HEC-1A经去甲基化药物5-aza-dC(10μM)处理后,细胞凋亡率显著上升,由3.81%上升至27.04%,抵抗凋亡的能力受到明显抑制。见图6结论：1.子宫内膜癌细胞系中检测到VEGF-C启动子区低甲基化状态,应用去甲基化药物5-aza-dC可使VEGF-C mRNA表达水平较低,说明子宫内膜癌中VEGF-C低甲基化导致基因组不稳定性增加,是肿瘤发生的重要原因之一。2.子宫内膜癌细胞系经去甲基药物处理后,VEGF-C蛋白表达水平降低。说明去甲基化药物抑制了VEGF-C的基因转录功能,使蛋白表达降低。3.VEGF-C基因的甲基化水平可作为评估甲基化干预是否有效的分子学标志物,为子宫内膜癌的临床治疗提供新的分子靶点。