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植物修复(phytoremediation)是近来发展起来的一种利用合适的超富集植物彻底清除重金属污染的绿色技术。该技术以其费用低廉、生态友好等优点成为环境科学的研究热点。为了克服植物修复技术中超富集植物生长缓慢和可收获的生物量小等的限制，将外源基因在植物体内高效表达能够提高植物吸收和运输重金属的能力。根据细胞内重金属的分布特点，将外源基因于一定亚细胞区域表达也被证明能够有效提高植物对重金属的抗性和富集能力。本文以大肠杆菌Cu结合蛋白CusF及其突变形式mCusF[CusF(M47C/M49C)]为研究对象，分别将其定位到拟南芥的不同亚细胞区域（细胞壁、液泡和细胞质），比较研究不同亚细胞定位的CusF/mCusF对转基因拟南芥重金属积累及抗性的影响。本研究主要内容包括： ⑴将来源于菜豆素(phaseolin)的信号肽取代CusF的信号肽后能够使CusF在拟南芥细胞壁和细胞间隙中表达。免疫印迹能够检测到CusF的两种存在形式（前体蛋白和成熟蛋白）。所获得的转基因拟南芥植株(CusFcw)的生长明显好于野生型。短期Cu处理(100μM，48 h)和长期Cu处理(500μM，40d)后，CusFcw转基因植株根部的Cu含量均显著高于野生型植株，分别比野生型植株高30-100％和60-170％，而地上部的Cu含量变化不明显。实时荧光定量PCR分析铜转运蛋白(COPT2、ZIP2、ZIP4、HMA5、YSL2和YSL3)在转录水平的表达后发现，正常条件下，CusF的存在使根部COPT2，ZIP2和YSL2的表达下调，ZIP4的表达上调，然而在Cu胁迫条件下这些蛋白在转录水平的表达变化不大。 ⑵将来源于菜豆素(phaseolin)的液泡分选信号AFVY与CusFcw-GFP的C端融合，发现CusF能够成功定位到拟南芥细胞的液泡中。免疫印迹能够检测到CusF的两种存在形式。所获得的转基因植株（CusFvac）的根长约比野生型植株长10-21％，鲜重均比野生型植株高13％。短期Cu处理后，CusFvac转基因植株地上部的Cu含量比野生型植株高。长期Cu处理后，CusFvac转基因植株根部的Cu含量高达野生型植株的3倍，而地上部的Cu含量变化不显著。与CusFcw转基因植株类似，Cu处理下，CusFvac转基因植株中的铜转运蛋白在转录水平的表达与野生型植株差异不大。 ⑶去除信号肽的CusF于拟南芥中表达后，发现其只存在于细胞质中。获得的转基因植株(CusFcyto)的生长与野生型植株没有差异。短期Cu处理后，CusFcyto转基因植株根部和地上部Cu含量与野生型相比变化不大。而长期Cu处理后，CusFcyto转基因植株根部和地上部Cu含量显著增加，分别是野生型植株的2.6倍和3.2倍。值得注意的是，CusFcyto转基因植株的Cu转移系数（地上部Cu含量/根部Cu含量）显著高于CusFcw和CusFvac转基因植株，约是后者的2倍。Cu胁迫下，CusFcyto转基因植株中Cu转运蛋白在转录水平的表达与野生型植株类似。 ⑷mCusF在拟南芥的细胞壁靶向表达可提高转基因植株(mCusFcw)的抗Zn性。短期Zn处理(500μM，3d)后，转基因植株根部的Zn含量是野生型的1.5倍，地上部的显著低于野生型植株的;而长期Zn处理(500μM，14d)后根部Zn含量与野生型相当，地上部Zn含量是野生型的1.5倍。Cd胁迫下，mCusFcw转基因植株的生长明显好于野生型植株。短期Cd处理(500μM，3d)后，转基因植株根部的Cd含量与野生型相当，地上部含量是野生型的3-4倍;而长期Cd处理(500μM，14d)后，转基因植株根部的Cd含量与野生型相当。 ⑸将mCusF靶向表达在拟南芥细胞的液泡中，可显著减轻Zn胁迫对转基因植株(mCusFvac)生长的抑制作用。短期Zn处理后，mCusFvac转基因植株根部的Zn含量是野生型植株的1.1-1.9倍，而地上部的显著低于野生型植株。长期Zn处理后，mCusFvac转基因植株根部和地上部的Zn含量都比野生型植株高，分别为野生型的1.2-2.1倍和1.3-2.3倍。Cd胁迫下，mCusFvac转基因植株的主根长度和鲜重与野生型相比，有显著差异，分别比野生型的高48-97％和36-112％。短期Cd处理后，转基因植株根部的Cd含量与野生型相当，地上部最高可达野生型的4.8倍;而长期Cd处理后，除mCusFvac2转基因株系根部与地上部均高于野生型植株外，其余株系的Cd含量与野生型相当。 ⑹细胞质靶向表达的mCusF能够显著提高转基因植株的抗Zn性。短期Zn处理后，mCusFcyto转基因植株根部的Zn含量约为野生型的1.2-2倍。长期Zn处理后，转基因植株根部的Zn含量与野生型相比，没有显著差异，而植株地上部Zn含量明显增加，是野生型植株的1.2-1.9倍。与CusFcyto转基因植株一样，mCusFcyto转基因植株能促进Zn向地上部分的转运。Cd胁迫下，mCusFcyto转基因植株的主根长度和鲜重均显著大于野生型植株的。短期Cd处理后，mCusFcyto1和mCusFcyto2转基因株系根部的Cd含量是野生型的2.2-2.4倍，4个株系地上部Cd含量均显著高于野生型;而长期Cd处理后，mCusFvac转基因株系根部Cd含量与野生型相当，株系（mCusFcyto1和mCusFcyto2）地上部Cd含量是野生型的1.5倍。