目前,抗生素在动物生产中的广泛使用,使得动物源细菌的耐药现象十分严重。β-内酰胺类抗生素能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性,从而阻断细菌细胞壁的合成而呈现广谱、高效的杀菌活性,广泛应用于畜牧生产,以控制奶牛乳房炎、细菌感染引起的畜禽胃肠道、呼吸道等疾病。但是β-内酰胺类抗生素的过度使用不仅使动物源细菌对其产生耐药性、增加了畜禽内源性感染的风险;而且长期使用会造成畜禽机体的免疫力下降和抗生素在畜产品与环境中的残留。畜禽产品和环境中抗生素的残留、及其携带的耐药菌可通过食物链影响人类健康,增加人类细菌性感染疾病治疗的难度。畜禽肉是人类日常膳食的重要组成部分,是人类优质蛋白的首要来源,也是耐药细菌向人类传播的一个重要途径。大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)是动物肠道固有菌,也是致人腹泻的主要病原菌之一,因此监测畜禽肉中大肠杆菌的耐药水平、研究其耐药性的来源与传播机制,对于指导畜牧生产中抗生素的合理使用和保障人类健康具有重要的意义。超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)由细菌质粒介导,是导致大肠杆菌等革兰氏阴性菌对广谱β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。本研究以深圳市各大超市及市场的畜禽肉样品为对象,对大肠杆菌进行分离、鉴定,对其耐药水平、耐药质粒的水平转移以及ESBLs耐药基因的遗传环境进行研究,以阐明畜禽肉源大肠杆菌耐药性的来源和传播方式。本研究包括以下部分:1.畜禽肉源大肠杆菌的耐药性分析及ESBLs和磷霉素耐药基因检测本试验旨在了解目前深圳市畜禽冷鲜肉源大肠杆菌的耐药情况,监测产CTX-M型ESBLs菌株的检出率、流行特征、耐药表型以及基因型,为指导畜牧生产中β-内酰胺类抗菌药物的合理使用,减少其耐药程度和控制其耐药性的传播扩散提供一定的理论依据。首先,试验采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的琼脂稀释法,对分离自120份畜禽冷鲜肉的80株大肠杆菌进行13种抗生素的耐药性检测。结果表明,80株大肠杆菌对12种抗生素均有不同程度的耐药,对美罗培南敏感;55株头孢噻肟耐药的大肠杆菌对其他种类抗生素表现出不同水平的耐药性,比如四环素(78%)、萘啶酸(71%)、磺胺甲噁唑甲氧苄啶(65%)、氯霉素(58%)、环丙沙星(56%)、卡那霉素(47%)、磷霉素(22%);多数分离菌株表现出多重耐药性。第二,采用PCR法检测55株头孢噻肟耐药大肠杆菌中ESBLs及磷霉素耐药基因的分布情况。结果显示,在55株头孢噻肟耐药的大肠杆菌中,有37株检测到blaCTX-M基因,16株检测到blaCMY-2基因,4株检测到blaACT-2基因;磷霉素耐药基因(fosA3)在12株头孢噻肟耐药大肠杆菌中检测到,且foA3基因只存在于blaCTX-M阳性菌株中,而在blaCMY-2和blaACT-2阳性菌株中并未发现。综上所述,深圳市畜禽肉源大肠杆菌对常用抗生素的耐药水平都不低,且多数大肠杆菌表现出多重耐药性。畜禽肉源产ESBLs大肠杆菌的基因型以CTX-M型和TEM型为主,CTX-M型ESBLs是深圳市畜禽肉源大肠杆菌对头孢类抗生素耐药的重要原因。2.畜禽肉源大肠杆菌blfaCTX-M基因的传播机制研究本试验旨在研究畜禽肉源blaCTX-M阳性大肠杆菌质粒的水平转移,分析耐药基因的遗传环境,以阐明畜禽肉源大肠杆菌耐药性的来源和传播方式,为指导临床用药和控制畜禽肉源细菌耐药基因向人类的传播提供科学依据。首先,以blaCTX-M阳性大肠杆菌为供体菌,以大肠杆菌J53为受体菌进行接合实验,以证明blaCTX-M基因的可转移性。结果表明,37株blaCTX-M阳性大肠杆菌中有15株将耐药性转移到受体菌内,CTX-M型基因中CTX-M-1组相较于CTX-M-9组更容易通过接合方式转移质粒。第二,采用PCR扩增法对15株接合子进行质粒的复制子分型,分析接合性质粒的主要类型。结果表明,15株接合子中10株分型成功,主要有三种类型,包括Inc I1型6株,IncFII型3株及IncFIV型1株,其余5株分型失败。第三,利用IS26、ISEcp1等插入序列分析blaCTX-M及fosA3基因的遗传环境。结果表明,在5株接合子的CTX-M-55基因上游区域检测到插入序列IS26,同时在下游检测到ORF477;在2株接合子的fosA3基因上游区域也检测到IS26插入序列;ISEcp1、ISCR1和IS903在15株接合子中均未检测到。第四,采用S1-PFGE及Southern杂交,深入分析大肠杆菌接合性质粒的传播机制。结果表明,多数大肠杆菌携带多种不同大小的质粒,blaCTX-M基因主要位于四种不同大小的接合性质粒上,分别是78kb、104kb、130kb和138kb。综上所述,畜禽肉源大肠杆菌blaCTX-M基因的传播主要是以质粒的水平传播为主,克隆传播占极少数。细菌可通过接合方式将耐药性质粒转移到受体菌,从而实现耐药基因在不同细菌间的传播和扩散。3.畜禽肉源blaCTX-M阳性大肠杆菌分子流行病学分型本试验旨在研究blaCTX-M阳性大肠杆菌间的亲缘关系,探究接合性质粒在畜禽肉源大肠杆菌中的传播途经,为指导畜牧养殖业合理使用抗生素和控制细菌耐药性的广泛传播提供理论基础。首先,通过大肠杆菌种族系统进化分析,阐明可接合大肠杆菌的分子流行病学分型,结果表明9株携带接合性质粒的大肠杆菌属于B1组,其次是A组和D组,未发现菌株属于B2组,表明该15株可接合的大肠杆菌大多属于肠道共生型菌株,而非毒力型菌株。其次,MLST分型结果表明,15株可接合大肠杆菌的MLST分型多达11种,呈现高度的多样性;其中包括ST156型3株、ST155型2株和ST88型2株等;但是没有检测到ST131型。第三,通过PFGE分型研究blaCTX-M阳性大肠杆菌间的同源性关系,分析可接合大肠杆菌间的亲缘关系,从而探究blaCTX-M基因在畜禽肉源大肠杆菌间的传播途经。PFGE分型结果表明,34株blaCTX-M阳性大肠杆菌中有29种不同的PFGE图谱,且大部分菌株呈现唯一的PFGE图谱;15株可接合大肠杆菌呈现出14种不同的PFGE图谱,表明携带blaCTX-M基因的大肠杆菌同源性较低,极个别菌株存在克隆传播现象。综上所述,畜禽肉源大肠杆菌blaCTX-M基因的传播以水平传播为主,同时存在零星的克隆传播;耐药基因水平传播的方式使得耐药性的传播更加广泛复杂,加剧了日益严重的耐药形势。全文结论:深圳市畜禽肉源大肠杆菌对抗生素呈现出较高水平的多重耐药性,ESBLs基因的流行比较普遍,blaCTX-M基因是造成畜禽肉源大肠杆菌对头孢类抗生素高水平耐药的主要原因。大肠杆菌对于头孢类抗生素的耐药性易通过接合方式在大肠杆菌之间相互传递。产ESBLs大肠杆菌blaCTX-M基因的传播以质粒的水平转移为主,但部分菌株也存在克隆传播。畜禽肉源大肠杆菌的blaCTX-M基因多位于Inc I1型和Inc FII型质粒上,其中以Inc I1型为主。插入序列IS26和ISEcp1与blfaCTX-M基因的传播密切相关,基因环境的多样性促进了耐药基因在细菌间快速广泛的传播。畜禽肉源大肠杆菌携带blaCTX-M基因将是一个严重的公共卫生问题,提醒我们应加强动物养殖环节抗生素使用的监控,从源头控制耐药细菌的产生,同时加强畜禽肉源细菌耐药性的监测和耐药机制的研究,为指导临床用药和控制畜禽肉源细菌耐药基因向人类的传播提供了科学依据。