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细菌素作为一种天然生物防腐剂,无毒、无残留、绿色安全,目前研究显示乳酸菌是细菌素的巨大来源库,而关于人体肠道重要优势菌群双歧杆菌所产细菌素的报道非常有限。本课题拟筛选得到一株有自主知识产权的产细菌素双歧杆菌优良菌株,优化其产细菌素的发酵条件,建立快速有效的提取纯化方法,并对其理化及生物学特性和分子结构进行初探。所得主要研究结果与结论如下:(1)成功从母乳婴儿源粪便样品中分离出一株具有显著抑菌作用的双歧杆菌优良菌株,经鉴定其为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis),命名为BB04,排除各种干扰因素后确定其所产抑菌物质为细菌素,并将其命名为bifidocin A。(2)通过单因素及响应面法优化,得到双歧杆菌代谢产细菌素bifidocin A的最佳条件为:发酵时间40.28(40.5)h,发酵温度34.55(35)℃,发酵起始pH6.75。利用此条件发酵双歧杆菌BB04,所产细菌素效价可达到787.3 AU/m L,是优化前的1.3倍。(3)基于细菌素的阳离子和疏水特性,建立了双歧杆菌细菌素bifidocin A的四步提取纯化方法:硫酸铵盐析--SP Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱--葡聚糖凝胶G-10层析色谱--C18反相高效液相色谱。纯化后得到的细菌素比活力高达5535 AU/mg,纯化倍数达到115倍。(4)特性试验结果显示:双歧杆菌细菌素bifidocin A可在50-100℃处理30min后保留70%以上活性,121℃加热20min活性残留50%以上;在pH3.0-8.0范围比较稳定,活性可保留60%以上,pH2.0环境中只能发挥30%的抑菌作用,pH11.0使其完全失活;对蛋白酶K、酸性蛋白酶和胃蛋白酶十分敏感,胰蛋白酶和中性蛋白酶可使其部分失活;该细菌素有较宽抑菌谱,可抑制多种G+菌、G-菌、真菌,尤其大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌、丁酸梭菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、热死环丝菌、酵母菌等。同时,确定细菌素bifidocin A的作用方式为短时间迅速杀菌,其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为640AU/mL和2560AU/m L。此外,细菌素对指示菌细胞吸附效果受温度和时间影响较小,受pH和盐离子浓度影响较大。(5)分子结构测定结果可知:双歧杆菌细菌素bifidocin A的分子量为1198.7Da;N端前10个氨基酸序列为Val–Phe–His–Pro–Gly–Thr–Gly–Pro–Pro–Gly(VFHPGTGPPG),推测未测出的氨基酸可能是Asp(D)和Leu(L);bifidocin A二级结构主要为含量58%以上的无规则卷曲结构、27%左右的β折叠结构和12%左右的β转角,且其在亲水环境和疏水环境中结构无明显变化,是一种非规则蛋白三级结构的新型三级结构。综上所述,研究所得双歧杆菌BB04为国内外首次报道产细菌素动物双歧杆菌菌株,该菌株所产细菌素bifidocin A不仅抑菌谱广、抑菌活性强、安全性高,而且具有很好的食品加工特性,有作为天然食品防腐剂的巨大应用前景。