近年来,海水观赏鱼越来越受到人们的青睐,灰额刺尾鱼（Acanthurus glaucopareius）作为一种常见的海水观赏鱼,以其艳丽的色彩、优美的体形而倍受人们的喜爱,然而由于养殖过程中的疏忽及防病意识的淡泊,导致大量鱼病的出现。灰额刺尾鱼溃疡病作为一种典型的疾病,本试验从临床病症上诊断灰额刺尾鱼溃疡病,并对该病的病原学进行研究,检测胞外产物是否为该病的毒力因子,为以后的养殖生产提供更多的理论依据。海南某观赏鱼场中,灰额刺尾鱼出现行动迟缓,食欲减退,体表溃烂,鱼鳍伴有充血现象,眼球突出,晶体混浊,角膜溃烂,肠道内无内容物,肝脏肿胀,肾脏肿大,肛门红肿等病症。从灰额刺尾鱼体表溃烂处及鳃部采样显微镜镜检,未发现有寄生虫寄生,尾静脉采血用Giemsa染色法制作血涂片,观察到有白细胞数量增多。再从体表溃烂处及内部器官中分离到五株有较强致病力的菌株,人工回归感染试验选用注射和浸泡两种方式,感染浓度都为3×10⁸CFU/mL,结果表明浸染组的感染率为75%,而注射组为100%。从人工感染发病的灰额刺尾鱼病灶部位再次分离的优势菌与其菌株C100311的生理生化性质一致,回归感染灰额刺尾鱼后仍能出现与自然发病情况下相同的症状,结果表明菌株C100311为致病菌。对该病原菌进行了形态、生理生化反应测试,其主要特征为革兰氏阴性,具动力的短杆菌,无芽孢。生理生化试验及Biolog全自动微生物鉴定系统结果显示为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）。应用细菌16S rDNA的通用引物对该菌基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1392bp的核苷酸序列,该序列与溶藻弧菌（登录号GQ455008）的16S rDNA基因序列同源性达99%,进一步确定该致病菌为溶藻弧菌。采用纸片法进行药敏试验,结果表明,该菌株对痢特灵、氟哌酸、环丙沙星等药物敏感,该菌株对甲氧胺嘧啶、氨苄青霉素、阿米卡星、青霉素等药物耐药。采用玻璃纸平板覆盖法提取菌株C100311的胞外产物（ECP）,用PBS洗下培养物,离心后上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤制备了胞外产物粗提液。用双层纸片法鉴定该胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶及溶血性。首先确定硫酸铵的最适饱和度为70%,利用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶层析及Microcon超滤离心管浓缩等蛋白纯化步骤后,ECP粗提液经过Sephadex G-25凝胶过滤层析,洗脱曲线有一个蛋白吸收峰,收集该峰的洗脱液。采用考马斯蓝法测定蛋白含量,以偶氮酪蛋白底物测定酶活力,测定纯化倍数为3.62,产率为19.0%。再经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）得到一分子量为33kD的胞外蛋白酶（ECPase）,将浓缩蛋白以2倍倍比稀释法对灰额刺尾鱼进行致病性研究,结果表明该致病该蛋白酶对灰额刺尾鱼有一定的致病性,蛋白浓度为0.836mg/mL时,肌肉注射灰额刺尾鱼8小时后,开始陆续出现死亡,注射处出现明显的溃疡病灶,局部肌肉溶解坏死,死亡率达87.5%。蛋白浓度为0.104mg/mL时,肌肉注射灰额刺尾鱼后,逐步出现食欲下降、行动迟缓、反应迟钝等症状,死亡率仅为12.5%,对灰额刺尾鱼的半数致死浓度达到0.63μg/g体重,证明溶藻弧菌的胞外蛋白酶是一种毒力因子。菌株C100311的胞外蛋白酶能被苯甲基磺酰氟（PMSF）完全抑制酶活性,说明该蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶。该酶最适反应温度为50℃,对热不稳定,最适pH为9,最适温度范围为30-50℃,最适pH范围为8-10,符合灰额刺尾鱼的生长环境。不被SDS、EDTA、Urea抑制酶活力,Mg²⁺、Ca²⁺能轻微提高酶活力,Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺离子则能显著地降低酶活力,这为临床用药提供了指导作用。