落叶松是我国北方中高山地区重要的速生造林用材树种。落叶松体细胞胚发生是细胞工程规模化繁育的理想实验体系,也为林木基因功能研究提供了优良材料。本课题组已经对落叶松体细胞胚发生的形态发生、生理生化、分子调控等不同层次进行了研究,揭示了落叶松体细胞胚发生过程中胚性维持以及畸形胚率高等分子机制。近年研究证明氢分子作为一种新型的抗氧化剂或信号分子,在植物和动物中有促进细胞增殖、调控细胞周期与凋亡,缓解氧化损伤以及延缓细胞衰老等功能。但是目前外源氢处理对植物体细胞胚的作用尚不清楚。本研究旨在通过在体细胞胚发生过程中进行氢处理(富氢培养)优化落叶松体细胞胚发生体系,进一步研究富氢培养对早期原胚(pro-embryogenic masses,PEMs)和子叶胚发育的影响及mRNAs、miRNAs的分子调控机制,主要结果如下:1、分析了富氢培养对落叶松S287细胞系的PEMs胚性维持、PEMIII发育的同步化及子叶胚数量和质量的影响,结果表明:与对照相比,富氢培养的早期原胚增殖鲜重提高了18.9%,PEMIII同步化率提高了25.4%,活性PEMIII提高了12.9%;持续富氢培养后早期子叶胚形成率提高了10.3%,正常成熟子叶胚的形成率提高了19.4%。早期原胚的ROS水平降低了53.6%,SOD、CAT和POD抗氧化酶活性分别提高了89.2%、76%、21.4%。这些结果表明氢参与调控了早期原胚和子叶胚的发育。2、构建了富氢和对照培养0 h、12 h、48 h、7 d、21 d和36 d的PEMs 22个cDNA文库,通过RNA-seq测序,共获得572103351个clean reads,de novo组装后得到62729个转录本(transcripts)和45393个基因(unigenes)。鉴定得到4253个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),与对照相比,富氢培养后2379个DEGs上调表达,1874个DEGs下调表达。GO/KEGG富集分析表明许多DEGs与ROS稳态平衡调节、细胞程序化死亡、细胞周期调控和植物激素信号转导等途径密切相关。3、进一步对上述材料进行miRNA测序,共获得了315个miRNAs,分析发现有49个miRNAs分属于40个已知保守miRNAs家族。基于miRNA*对应序列和miRNA特征茎环结构,鉴定了266个新miRNAs。23个保守miRNAs家族成员在早期原胚阶段和体细胞胚成熟阶段都表达,但表达量差异明显;有17和16个保守miRNAs分别在早期原胚阶段和体细胞胚阶段特异性表达。这些结果表明更多的未知的miRNAs参与调控了落叶松早期原胚发育以及体细胞胚发生过程中早期原胚发育阶段与体细胞胚成熟阶段具有明显不同的miRNAs表达谱。4、筛选获得96个差异表达的mi RNAs,与对照相比,49个上调表达,47个下调表达。进一步预测了285个miRNAs对应4399个目标基因。在12 h、48 h、7 d、21 d和36d文库中,分别有8、13、5、7和8个差异表达的miRNAs,调控了8、40、5、9和10个差异表达的目标基因。其中,共有42对miRNAs与其调控的目标基因之间存在负调控关系,并构建了miRNAs-目标基因调控网络。结果表明miRNAs与mRNAs共同协调参与早期原胚对富氢培养的响应通路。5、克隆并鉴定了落叶松关键抗氧化酶—铜锌超氧化物歧化酶基因LlCuZnSOD。通过生物信息学、序列比对和分子系统树分析发现CuZnSOD在细菌、植物和动物中高度保守。qRT-PCR结果显示LlCuZnSOD在早期原胚发育阶段表达活跃并在体细胞胚成熟早期达到峰值,而在体细胞胚成熟晚期急剧下降。通过原生质体瞬时转染的方法进行亚细胞定位分析,发现该蛋白质定位于细胞质中。综上所述,富氢培养促进落叶松早期原胚增殖和发育同步化,延缓细胞衰老,提高胚性细胞存活率,促进落叶松体细胞胚成熟,提高正常成熟子叶胚形成率。因此,富氢培养可以用来优化落叶松体细胞胚发生体系。而且转录组数据表明落叶松早期原胚对外源氢的响应应答涉及多条生物学途径和过程。落叶松早期原胚在富氢培养过程中基因和mi RNAs的表达水平变化及miRNAs-目标基因网络将有助于更全面地了解氢在落叶松早期原胚发育过程中调控作用的分子机理。另外,这些分析不仅为将来进一步解析落叶松体细胞胚发生的分子调控网络提供了新的视角和数据资源,也为落叶松细胞工程规模化繁育的生产实践提供了确实可行的方法。