论文部分内容阅读
青蒿素来源于中国传统药用植物青蒿,即植物分类学上的黄花蒿(Artemisia annuaL.),它是具有内过氧桥的倍半萜内酯,是目前治疗疟疾的最有效药物之一。青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。本论文研究了青蒿素生物合成途径中的重要倍半萜合酶紫穗槐二烯合酶(ADS)以及和ADS蛋白序列相似性非常高的倍半萜合酶α-没药醇合酶(AaBOS),分析了两个酶的催化活性及产物特异性与结构(包括一级序列和三级序列)的关系。 ADS是青蒿素生物合成途径中的倍半萜合酶,在青蒿的腺毛细胞中高表达。ADS催化底物法呢基焦磷酸(FPP)环化生成青蒿素的重要前体紫穗槐-4,11-二烯(amorpha-4,11-diene)。分析了ADS基因的表达特征,发现它在茎和花中高表达,其次是幼叶,在根和老叶中表达量低。通过根癌农杆菌介导的方法将ADS基因转入青蒿,得到了数株高表达ADS基因的转基因青蒿。分析后发现转基因青蒿的青蒿素含量约是对照植株的1.8倍,青蒿酸含量约是对照的4倍。还发现转基因青蒿中不仅ADS基因的表达量提高,青蒿素合成途径中的其它基因的表达量也都有所上调,包括上游的HMGR(HMG-CoA reductase)、FPS(farnesyl diphosphate synthase)以及下游的CYP71AV1(amorpha-4,11-diene C-12 oxidase)。 由于青蒿的腺毛中能够表达许多次生代谢的基因,积累包括青蒿素在内的大量的萜类化合物及其衍生物,利用青蒿腺毛细胞构建了EST库,通过序列分析得到了数个萜类合酶的EST序列。利用5’和3’-Race的方法,获得了六个萜类合酶的全长序列。原核表达和体外酶活实验分析表明,其中一个倍半萜合酶可以产生α-没药醇(α-bisabolol),命名为α-没药醇合酶(AaBOS),这是第一个在植物中克隆鉴定到的α-没药醇合酶。 AaBOS的编码区核苷酸序列和蛋白序列上都与ADS有很高的一致性,分别达到92%和82%,且两者的组织表达特征相似。这两个倍半萜合酶提供了一个很好的模型用以研究萜类合酶中影响产物特异性和酶活性的结构域以及氨基酸残基位点。对AaBOS和ADS进行了结构域置换和点突变,通过体外酶活性的实验发现,AaBOS四个位点(V373,1395,N398和L399)的突变能改变AaBOS产物特异性,即改变了AaBOS产物中萜烯类和醇类的比例,使反应更倾向于反应产生萜烯类的倍半萜。为了从机理上阐释为何这些结构域和氨基酸残基位点能够影响.AaBOS和ADS的产物特异性和酶活性,解析了AaBOS蛋白的晶体结构。通过蛋白结构分析,发现了一个新的motif——BOS。BOS motif包含了位于helix F上的V373,以及helix G上的1395、N398、L399四个位点。这四个位点在蛋白的三维结构上紧邻,突变后会改变helixF和helix G的位置及催化活性中心疏水口袋的大小,从而影响酶与底物的结合作用;同时,399位点所在的Helix G的改变,也能影响酶活性中心与底物的相互作用。通过结构分析和氨基酸突变,我们将AaBOS从α-没药醇合酶变为了另外一个新倍半萜合酶。进一步实验发现,在ADS中位点T399被不同的氨基酸残基取代后,可以改变ADS产物特异性及催化活性。将ADS399位的苏氨基酸突变为丝氨酸,突变后的ADS催化活性提高了约72%。此ADS突变体在植物基因工程以及微生物发酵工程中具有应用潜力,为提高青蒿素或青蒿酸的产量、降低青蒿素生产成本提供了工具。